表达IL-35的大肠杆菌在缓解小鼠溃疡性结肠炎中的应用研究

摘要

背景： 溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病灶发生在结肠和直肠肠道的慢性非特异性炎症，与克罗恩病共同合称为炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）[1]。溃疡性结肠炎的具体发病机制仍未完全阐明。但现在的一些研究结果认为其发病可能为免疫系统紊乱和细胞因子的表达失衡共同作用的结果。白介素[2,3]作为一种由多种细胞产生的可溶性淋巴细胞因子。通过激活与调节各种免疫细胞，并且在各细胞间传递各种信息。其发挥的生理作用主要位于白细胞和其他免疫细胞之间，可以介导Tcell和B cell的活化、增殖与分化用以维持机体内环境免疫系统的平衡。炎症性肠病患者体内的细胞因子在肠道慢性非特异性炎症的发生中起着至关重要的作用。白细胞介素-35（Interleukin-35，IL-35）作为一种负性炎症调控的关键细胞因子，已被认定为潜在治疗UC的治疗手段。然而，常规用药途径有着生产程序复杂，造价成本昂贵，保存条件要求高和到达病灶药物有效浓度低等限制因素。本实验旨在利用新颖的药物传递途径，通过灌胃将表达IL-35的大肠杆菌输送到小鼠病变肠道以探究其对葡聚糖硫酸酯钠（DSS）诱导实验小鼠溃疡性结肠炎的作用。 目的： 构建表达IL-35的大肠杆菌，利用DSS建立小鼠溃疡性结肠炎模型，研究表达IL-35的大肠杆菌在缓解小鼠溃疡性结肠炎的作用及机理。 方法： (1)将含有IL-35的基因片段插入空质粒pET-28a(+)构建成重组质粒pET-28a(+)-IL35。将重组质粒转化入感受态大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）BL21（DE3）菌株，合成表达IL-35的重组大肠杆菌（E.coli/IL-35）。 (2)实验将成年BALB/c小鼠30只通过用3%DSS自由饮用的给药方法5天诱导出BALB/c小鼠UC模型。对照组为正常小鼠10只。小鼠UC模型随机分为三组（n=10）分别通过灌胃针给予PBS、空质粒E.coli（E.coli0）和表达IL-35重组大肠杆菌（E.coli/IL-35）5天。分别为normal组、DSS组、DSS+E.coli0组、DSS+E.coli/IL-35组。记录造模期间小鼠的疾病活动指数（DAI）、测量自然状态下结直肠长度及结肠组织HE染色和免疫组织化学染色，测定血浆和组织促炎和抗炎细胞因子水平以及运用流式细胞术检查特异性淋巴细胞亚群的反应。 结果： (1)构建含IL-35基因的重组质粒，并转化入感受态大肠杆菌构建重组大肠杆菌E.coli/IL-35，成功表达IL-35。 (2)通过灌胃方法给予重组E.coli/IL-35可缓解DSS诱导UC小鼠的体重减轻和结肠长度的缩短，DAI指数和病理学评分显著降低，减少中性粒细胞和CD3+在结肠的浸润。结肠组织和血浆细胞因子IL-10和IL-35升高，细胞因子IL-6降低。此外，小鼠脾细胞及肠系膜淋巴结的CD4+IL-17A+Th17细胞显著减少及CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的升高。 结论： 在此研究中,我们首先成功构建表达IL-35的大肠杆菌E.coli/IL-35，之后通过灌胃方式给予E.coli/IL-35研究其对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎小鼠模型的作用。研究中我们发现E.coli/IL-35可缓解DSS诱导UC小鼠的体重减轻和结肠长度的缩短，DAI指数和病理学评分显著降低。免疫组织化学染色显示可以减少中性粒细胞和CD3+在结肠组织的浸润。结肠组织和血浆细胞因子IL-10和IL-35升高，细胞因子IL-6降低。此外，小鼠脾细胞及肠系膜淋巴结的CD4+IL-17A+Th17细胞显著减少及CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的升高。综上所述,这些数据强有力的证明E.coli/IL-35对小鼠溃疡性结肠炎有治疗效果。通过大肠杆菌携带免疫细胞因子的方法可能为治疗炎症性肠病提供新的思路。

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