背根神经节TRPM8膜转运和P2Y1R调控NMDA受体磷酸化在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用研究

摘要

目的：研究背根神经节TRPM8膜转运和P2Y1R调控NMDA受体磷酸化在瑞芬太尼痛觉过敏发生机制中的作用. 内容利用瑞芬太尼痛觉过敏大鼠模型,研究背根神经节TRPM8膜转运、NMDA受体磷酸化和P2YIR表达的改变,并明确TRPM8膜转运和P2YIR在瑞芬太尼痛觉过敏发生机制中的具体作用及NMDA受体磷酸化对其的介导作用. 方法：第一部分:瑞芬痛敏(R)组尾静脉输注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-160min;对照(C)组输注生理盐水(NS)60min.于尾静脉输注前24h,输注后2、6、24和48h(T0-4),每组取8只大鼠测定右后爪机械缩足反应阈(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)和冷板抬足次数(NPL)后处死,取右侧L4-6背根神经节(DRG),采用RT-qPCR测TRPM8、NMDA受体亚型NR1和NR2B及P2Y1R mRNA,western blot测总蛋白TRPM8、膜蛋白TRPM8、pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和P2Y1R水平,并计算膜蛋白和总蛋白TRPM8表达的比值(m/t TRPM8).第二部分实验一:对照(C)组和TRPM8拮抗剂(RQ)组腹腔注射NS或RQ-00203078.尾静脉输注NS60min;瑞芬痛敏(R)和瑞芬痛敏+TRPM8拮抗剂(R+RQ)组腹腔注射NS或RQ-00203078,尾静脉输注瑞芬太尼lμg·kg-1·min-160min.尾静脉输注前10min行腹腔注射.T0-4时测定右后爪MWT、TWL和NPL后处死大鼠,取右侧L4-6DRG,采用RT-qPCR测NR1和NR2B mRNA,western blot测pNR1、NR1、pNR2B和NR2B,免疫荧光测pNR1和pNR2B阳性神经元百分率.第二部分实验二:对照(NS+NS)组鞘内和腹腔皆注射NS;TRPM8拮抗剂(NS+RQ)组鞘内和腹腔注射NS和RQ-00203078;NMDA受体激动剂(NMDA+NS)组鞘内和腹腔注射NMDA和NS;NMDA受体激动剂+TRPM8拮抗剂(NMDA+RQ)组鞘内和腹腔注射NMDA和RQ-00203078.四组大鼠尾静脉皆输注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-160min.尾静脉输注前1h和10min分别行鞘内和腹腔注射,T0-4时测NPL.第三部分实验一:对照(C)组和P2Y1R拮抗剂(MRS)组鞘内注射NS或MRS2179,尾静脉输注NS60min;瑞芬痛敏(R)组和瑞芬痛敏+P2Y1R拮抗剂(R+MRS)组鞘内注射NS或MRS2179,尾静脉输注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-160min.尾静脉输注前10min行鞘内注射.T0-4时测右后爪MWT、TWL和NPL后处死大鼠,取右侧L4-6DRG,采用RT-qPCR测NR1和NR2B mRNA,western blot测pNR1、NR1、pNR2B和NR2B,免疫荧光测pNRI和pNR2B阳性神经元百分率.第三部分实验二:对照(NS+NS)组鞘内皆注射NS;P2YIR拮抗剂(NS+MRS)组鞘内注射NS和MRS2179;NMDA受体激动剂(NMDA+NS)组鞘内注射NMDA和NS;NMDA受体激动齐0+P2YIR拮抗齐0(NMDA+MRS)组鞘内注射NMDA和MRS2179;四组大鼠尾静脉皆输注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-160min.尾静脉输注前th和10min鞘内分别注射NMDA和MRS2179,T0.4时测MWT、TWL和NPL. 结果：第一部分:与C组比较,R组T1-4MWT降低、TWL缩短、NPL加,TRPM8、NR1、NR2B和P2Y1R mRNA增加,总蛋白和膜蛋白TRPM8、m/t TRPM8、pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和P2Y1R蛋白增加.R组随时间延长MWT逐渐降低,TWL逐渐缩短,NPL逐渐增多;TRPM8、NR1、NR2B和P2Y1R mRNA逐渐提升,总蛋白和膜蛋白TRPM8、m/t TRPM8、pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和P2Y1R蛋白逐渐增加.第二部分实验一:与C组比较,R组T1-4MWT降低,TWL缩短,NPL增多;与R组比较,R+RQ组T1-4NPL减少,MWT和TWL的差异无统计学意义.与C组比较,R组NR1和NR2B mRNA增加,pNR1、NR1、pNR2B和NR2B蛋白增加,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率增加;与R组比较,R+RQ组NR1和NR2B mRNA下降,pNR1、NR1、pNR2B和NR2B蛋白下降,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率降低.第二部分实验二:与NS+NS组比较,NS+RQ组T1-4NPL减少,NMDA+NS和NMDA+RQ组T1-4NPL增加;与NMDA+NS组比较,NMDA+RQ组T1-4NPL的差异无统计学意义.第三部分实验一:与C组比较,R组T1-4MWT降低,TWL缩短,NPL增多;与R组比较,R+MRS组T1-4MWT升高,TWL延长,NPL减少.与C组比较,R组NR1和NR2B mRNA增加,pNR1、NR1、pNR2B和NR2B蛋白增加,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率增加;与R组比较,R+MRS组NRI和NR2B mRNA降低,pNR1、NR1、pNR2B和NR2B蛋白降低,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率减少.第三部分实验二:与NS+NS组比较,NS+MRS组T1-4MWT增加、TWL延长、NPL减少,NMDA+NS和NMDA+MRS组T1-4MWT降低、TWL缩短、NPL增加;与NMDA+NS组比较,NMDA+MRS组T1-4MWT、TWL和NPL的差异无统计学意义. 结论：TRPM8膜转运的减少通过抑制NR1和NR2B的磷酸化削弱瑞芬太尼诱发的冷痛觉过敏.P2Y1R拮抗剂通过抑制NR1和NR2B的磷酸化削弱瑞芬太尼诱发的机械触诱发痛、热和冷痛觉过敏.

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