DOT1L促进乳腺癌转移的作用机制研究

摘要

研究目的： 乳腺癌是一种十分常见的恶性肿瘤，在女性癌症患者中有很高的比例，是威胁女性生命安全的一大“杀手”。乳腺癌是多种因素、多基因突变积累形成的复杂病变，和表观遗传变异有密切的关联。表观遗传变异是一种常见的可遗传变异，特点是在不改变基因序列的前提下调控基因的表达，表观遗传变异可以导致肿瘤、精神病、心血管病和自身免疫系统性病等疾病的发生。表观遗传修饰包括DNA甲基化作用、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控等，其中组蛋白修饰包括组蛋白甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化以及SUMO化等，对调控基因表达有重要的作用。组蛋白甲基化与转录激活和抑制相关，常出现在赖氨酸和精氨酸位点上，是被甲基转移酶催化完成的。催化组蛋白赖氨酸甲基化的甲基转移酶多数含有SET结构域，如EZH2，G9a等。而DOT1L是不含SET结构域的甲基转移酶，能甲基化H3K79。DOT1最早在酵母中发现，是种端粒沉默的抑制因子。DOT1L是人类DOT1的同源物，DOT1L介导的H3K79的甲基化有基因转录活化的功能，同时还可以结合53BP1，影响其和DNA双链损伤修复位点的结合。DOT1L介导的H3K79甲基化还能影响沉默信息调控因子SIRT蛋白与染色质的结合，抑制染色质的凝缩。DOT1L对癌症的发生和发展有重要的作用，是治疗白血病的重要靶点，但是DOT1L对乳腺癌具体的作用和分子机制还不明确。上皮间质转化（EMT）是肿瘤发展中的重要过程，与肿瘤细胞的转移和侵袭密切相关。我们以EMT的机制为切入点，研究DOT1L对乳腺癌转移发挥的作用，对乳腺癌发生和发展的机制研究有重要的意义。 研究内容、方法与结果： 首先，我们构建了HA-DOT1L表达载体，将其转染MCF-7细胞过表达，或者利用siRNA转染细胞将DOT1L敲低，检测到细胞中DOT1L的作用位点H3K79me2表达水平下降，这与已有的研究报道结果一致。同时，我们发现DOT1L的敲低使去乙酰化酶SIRT1在染色质上的结合水平升高，乙酰化酶MOF在染色质上的结合水平降低，但MOF和SIRT1的表达水平没有变化，细胞内H4K16乙酰化程度降低，这一结果揭示了DOT1L是通过影响乙酰化酶和去乙酰化酶在染色质上的结合来参与调控H4乙酰化。H3K79甲基化和H4K16乙酰化可以激活基因转录，说明DOT1L对基因转录调控有重要作用。其次，我们在MCF-7细胞中敲低DOT1L后，提取RNA并利用转录组测序技术（RNA seq）检测DOT1L在转录水平调控的基因，发现DOT1L可以在转录水平调控ZEB2的表达，进一步的蛋白质印迹法(Western blot)和荧光实时定量(qPCR)实验验证了此结论。再次，通过蛋白质免疫共沉淀(IP)实验确定了与DOT1L相互作用的蛋白ETS-1，并用染色质免疫沉淀（CHIP）技术发现DOT1L与ETS-1共同在ZEB2的启动区富集。由于受DOT1L调控的ZEB2是EMT相关基因，而EMT与肿瘤的转移和侵袭关系密切。最后，我们通过Western blot和qPCR实验证实了DOT1L对EMT中标志物的影响，并采用进一步的细胞体外侵袭实验（Transwell）和动物模型证实了DOT1L影响乳腺癌细胞的转移。 我们的研究揭示了DOT1L与ETS-1具有相互作用，募集在ZEB2的启动子区共同促进ZEB2的转录，对EMT过程有调控作用，在乳腺癌的转移进程中有重要的功能，为DOT1L可能成为乳腺癌的治疗靶点提供了有力证据。

目录

第一个书签之前

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、DOT1L能调控基因转录

1.1对象与方法

1.1.1材料

1.1.2方法

1.2结果

1.2.1 DOT1L在细胞中的过表达和敲低

1.2.2 DOT1L能调控H4K16ac的表达

1.3讨论

1.4 小结

二、DOT1L与ETS-1相互作用调控ZEB2的表达

2.1对象与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 DOT1L可以调控肿瘤转移相关基因ZEB2的表达

2.2.2 DOT1L与ETS-1有相互作用

2.2.3 DOT1L与ETS-1协同调节ZEB2的转录

2.3讨论

2.4小结

三、DOT1L促进乳腺癌细胞的转移和侵袭

3.1对象与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2 结果

3.2.1 DOT1L在转移性比较高的MDA-MB-231细胞中表达较高

3.2.2 DOT1L促进乳腺癌细胞上皮间质转化

3.2.3 DOT1L促进乳腺癌细胞的转移与侵袭

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参与科研情况说明

综述

DOT1L和H3K79甲基化

综述参考文献

致谢

个人简历