miR-27a对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及机制的研究

摘要

目的： 胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一,其死亡率位于恶性肿瘤第二位.虽然胃癌治疗方式有一定进展,但治愈率并没有得到相应的提高.因此寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义.日益增多的研究表明miRNAs参与了癌细胞增殖、分化、凋亡及侵袭等过程,且miRNAs可因被包裹于外泌体中而在体液中稳定存在.前期的研究发现在胃癌患者血清中miR-27a,miR-20、miR-34a、miR-1和miR-423-5p呈稳定的高表达状态,进一步收集病例资料发现miR-27a高表达的患者预后不良,提示miR-27a可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用.目前,miR-27a对胃癌的具体作用及机制尚不清楚.本研究旨在前期研究结果的基础上探索miR-27a在胃癌细胞外泌体中表达情况,研究miR-27a对胃癌细胞恶性生物学行为影响及机制,以期寻找到胃癌治疗新途径. 方法： 1.miR-27a在胃癌细胞外泌体中表达情况：Exoquick TC法收集胃癌细胞SGC-7901培养上清中的外泌体,通过透射电镜及Western blotting观察所收集的外泌体形态及其标志物,BCA-kit检测外泌体中蛋白浓度.实时聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测收集的外泌体中miR-27a、miR-20、miR-34a、miR-1和miR-423-5p的表达水平,并测定不同浓度外泌体中miR-27a的表达水平. 2.miR-27a过表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响：miR-27a过表达质粒瞬时转染细胞株后,CCK-8法初步检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白p53、BCL-2水平,并检测自噬相关的LC3I、LC3II蛋白水平. 3.miR-27a靶基因的获取、验证并确定miR-27a对靶基因的作用：通过生物信息学预测网站(http：//www.targetscan.org)预测miR-27a的靶基因,获得预测值较高的靶基因,应用双荧光素酶报告基因验证miR-27a与靶基因的靶点关系.Realtime PCR检测过表达/敲低miR-27a的SGC-7901细胞株靶基因mRNA的水平,Western blotting检测过表达/敲低miR-27a的细胞靶基因蛋白的表达的水平. 4.敲低靶基因的表达后对胃癌细胞恶性生物学行为的影响：通过瞬时转染得到靶基因低表达的SGC-7901细胞株,CCK-8法初步检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测细胞凋亡蛋白p53、BCL-2水平,并检测自噬相关的LC3I、LC3II蛋白水平. 结果： 1.胃癌细胞外泌体中miR-27a的表达：透射电镜下观察SGC-7901外泌体为椭圆形或圆形的囊泡状小体,直径约30-100nm,Western blotting检测SGC-7901细胞上清中外泌体标志物CD63高表达,BCA-kit检测外泌体中蛋白浓度为0.6ug/ul,与PBS中蛋白浓度差异显著.实时聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测收集的外泌体中5种miRNA的表达水平,结果显示miR-27a,miR-20和miR-34a表达量较高,而miR-1和miR-423-5p表达量较低,且miR-27a表达随着外泌体浓度升高而升高,表明胃癌细胞外泌体中miR-27a高表达. 2.miR-27a过表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响：CCK-8法检测结果显示,相对于NC组,上调SGC-7901细胞miR-27a后,细胞增殖速度加快(P<0.05).用流式细胞仪检测结果显示,与NC组相比较,miR-27a mimics转染48小时后可显著抑制SGC-7901细胞凋亡(P<0.05).上调miR-27a组凋亡相关蛋白p53表达下调,BCL-2表达上调,自噬相关蛋白LC3I、LC3II表达下降(P<0.05). 3.miR-27a靶基因FOXO1的获取、验证并确定miR-27a对FOXO1的作用：通过生物信息学预测软件获得miR-27a的预测值较高的靶基因FOXO1,应用双荧光素酶报告基因验证,结果显示,在SGC-7901细胞中,pre-miR-27a前体能够显著降低野生型FOXO13'UTR-pRL-TK重组质粒的荧光活性(P<0.05),而对突变型FOXO13'UTR-pRL-TK重组质粒没有影响(P>0.05).上调、下调miR-27a后,SGC-7901细胞中FOXO1mRNA水平无明显变化(P>0.05),FOXO1蛋白水平则分别下调、上调(P<0.05). 4.靶基因FOXO1低表达对对胃癌细胞恶性生物学行为的影响：CCK-8法检测结果显示,相对于NC组,敲低SGC-7901细胞FOXO1后,细胞增殖速度加快(P<0.05).用流式细胞仪检测结果显示,与NC组相比较,敲低FOXO1可显著抑制SGC-7901细胞凋亡(P<0.05).si-FOXO1组凋亡相关蛋白p53表达下调,BCL-2表达上调,自噬相关蛋白LC3I、LC3II表达下降(P<0.05). 结论： 1.胃癌细胞外泌体中miR-27a呈高表达,结合前期的研究结果,提示miR-27a在胃癌的发生发展中发挥重要作用.进一步研究miR-27a对胃癌细胞恶性生物学的影响,发现miR-27a过表达可通过促进胃癌细胞增殖,、抑制凋亡及自噬而促进胃癌的发生发展,推测miR-27a可为胃癌治疗的提供新的靶点. 2.通过生物信息学预测网站得到miR-27a预测值较高的靶点FOXO1,应用双荧光素酶报告基因检测验证了miR-27a与FOXO1存在靶点关系.mi-R27a可在蛋白水平上抑制靶基因FOXO1的表达.进一步探索FOXO1对胃癌细胞恶性生物学的影响,发现FOXO1低表达可通过促进胃癌细胞增殖,、抑制凋亡及自噬而促进胃癌的发生发展. 综合以上结论,可以初步得出miR-27a通过抑制靶基因FOXO1的表达而促进胃癌增殖、抑制凋亡及自噬的结论.mi-27a/FOXO1轴可为胃癌治疗提供新策略.

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