动态力学载荷下成骨细胞/3D打印复合支架材料三维培养模型的研究

摘要

目的： 由于临床上对骨修复体的需求量呈现快速增长，利用骨组织工程的方法研究并开发出骨缺损修复体，采用低温三维打印联合冷冻干燥技术制备丝素/胶原/纳米羟基磷灰石复合支架，构建成骨细胞的三维培养模型，观察动态力学载荷对低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内MC3T3-E1细胞增殖、分化、成骨特异性基因表达的影响，并采用酶解法研究复合支架的降解性能，为骨组织工程支架材料能够运用到临床提供理论依据。 方法： 1.丝素/Ⅰ型胶原/纳米羟基磷灰石复合支架的制备：将丝素/胶原/纳米羟基磷灰石按质量比为3∶9∶2混合，采用低温3D打印联合冷冻干燥技术制备三维多孔支架，Co60灭菌后-20℃保存备用。 2.丝素/Ⅰ型胶原/纳米羟基磷灰石复合支架理化性能检测：用Micro-CT对复合支架进行扫描，三维重建后得出复合支架的微观结构参数；用SEM观察复合支架表面的形态；用Instron5865材料力学试验机检测复合支架的力学性能。 3.构建成骨细胞的三维培养模型：将MC3T3-E1成骨细胞接种至复合支架上，采用智能材料-压电陶瓷加载装置对支架材料进行动态力学加载，加载参数为（3500με，1Hz，15min/d）。 4.复合支架细胞相容性检测：通过HE染色、SEM观察成骨细胞在复合支架上的生长情况，MTT法检测成骨细胞在复合支架上的增殖情况，Western blot法检测特异蛋白表达，qPCR法检测特异基因表达。 5.复合支架的降解性能：将复合材料置于1U/ml的Collagenase-IA缓冲溶液（pH7.4，37℃）中进行体外降解。计算降解率，用SEM观察复合支架降解之后的表面结构变化。 结果： 1.利用三维打印技术制备的丝素/胶原/纳米羟基磷灰石复合支架，内部呈现孔隙网状结构，孔隙连通性良好，孔隙率（91.8184±3.48）%，大孔直径为(504.32±17.62)μm，微孔直径为(62.29±16.55)μm，弹性模量为(162.43±18.76)kPa。吸水膨胀率(1341.85±63.35)%， 2.复合培养7、14d，两组HE染色及扫描电镜均见细胞在支架内部生长，主要分布在支架孔壁周围，其中实验组细胞较对照组增多，且细胞由梭形变为扁平状。除200倍镜下14d时两组细胞计数差异无统计学意义（p＞0.05）外，其余不同放大倍数下各时间点组间比较差异均有统计学意义（p＜0.05）。 3.MTT法检测结果显示力学加载后明显促进成骨细胞在复合支架上的增殖。 4.实时荧光定量PCR检测：实验组培养7、14d时COL-Ⅰ、OCN mRNA相对表达量与对照组比较，差异有统计学意义（p＜0.05），但BMP-2mRNA相对表达量与对照组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。Western blot检测，实验组培养7、14d时COL-Ⅰ、BMP-2、OCN蛋白相对表达量与对照组比较，差异均有统计学意义（p＜0.05）。 5.复合支架经过8周的降解，降解了77.44%。第1周为46.99%，第2周为49.62%，增长了2.63%，第4、6、8周分别为62.05%、69.91%、77.44%。分别增长了12.43%，7.86%和7.53%。降解速率由快变慢。 结论： 1.在三维培养条件下MTT检测及HE染色、SEM结果显示3500με动态压缩载荷明显促进了成骨细胞的增殖。 2.通过qPCR及Western-Blot检测BMP-2、COL-Ⅰ、OCN的mRNA和蛋白表达的结果显示3500με动态压缩载荷促进了成骨细胞在复合支架上的分化. 3.与二维培养条件相比，三维培养条件下更接近体内的真实情况，所以三维培养的结果更可靠。

目录

第一个书签之前