利拉鲁肽在脂肪细胞分化及白色脂肪棕色样变中的作用机制研究

摘要

目的：利拉鲁肽作为胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）长效类似物，除了很好的治疗糖尿病的特性外，近来的研究发现它也具有调控脂肪细胞的分化，激活棕色脂肪组织产热的重要作用，从而减轻体重，治疗肥胖症，但其具体机制尚未完全明了。本研究利用前脂肪细胞3T3-L1细胞系和高脂喂养的KKAy小鼠，研究利拉鲁肽在脂肪细胞增殖分化及白色脂肪棕色样变的中的作用，并探讨其作用机制。 方法：1.培养3T3-L1细胞，CCK8，ki67和AnnexinⅤ等实验检测拉鲁肽对细胞的增殖和凋亡的影响。成脂诱导培养3T3-L1细胞，qRT-PCR、western blotting检测脂肪分化的关键转录因子的mRNA和蛋白的水平，油红O染色技术检测脂滴的产生，观察利拉鲁肽对脂肪分化的影响。qRT-PCR、western blotting检测Hippo/YAP信号通路核心蛋白及其下游靶基因的表达。RNA干扰技术沉默Hippo/YAP信号通路的关键基因ste20激酶1(mammalian ste20kinase1，MST1)，检测脂肪标记性基因的mRNA和蛋白的表达水平，进一步阐明利拉鲁肽通过Hippo/YAP信号通路调控脂肪细胞的增殖与分化。2.采用高脂饮食喂养KKAy小鼠，给予外周注射利拉鲁肽12周，对照组给予相同体积的磷酸盐缓冲液，观察利拉鲁肽对小鼠体重的影响，12周后饲养结束，取小鼠的肾周脂肪和腹股沟脂肪。油红O染色和苏木精-伊红（HE）染色等技术观察利拉鲁肽对白色脂肪组织细胞及3T3-L1细胞成脂诱导分化过程中脂滴的变化。qRT-PCR、western blotting，免疫组织化学及免疫荧光的方法检测利拉鲁肽对白色脂肪组织细胞及3T3-L1细胞成脂诱导分化过程中棕色脂肪标记性基因和线粒体生物合成关键基因的mRNA和蛋白水平，观察利拉鲁肽在白色脂肪棕色变中的作用。qRT-PCR、western blotting检测体内与体外，可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylcyclase,sGC）信号通路关键蛋白及其下游靶基因的表达，此外，通过sGC的激活剂BAY41-8543和sGC的抑制剂NS-2028，检测sGC、下游靶基因、棕色脂肪标记性基因和线粒体生物合成关键基因的mRNA和蛋白表达量，进一步揭示sGC依赖性途径在利拉鲁肽诱导白色脂肪发生棕色样变中调控作用。 结果:1.与对照组相比，成脂诱导培养3T3-L1细胞，在成脂分化的早期，利拉鲁肽促进3T3-L1细胞的成脂分化，增强脂肪分化的关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）、CCATT增强结合蛋白α（CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα）和表征因子脂肪酸结合蛋白（adipocytefatty acid-binding protein,aP2）等表达。利拉鲁肽抑制3T3-L1的细胞增殖，且具有浓度依赖性，但并不影响它的凋亡。利拉鲁肽在抑制3T3-L1的细胞增殖和脂肪分化的早期阶段激活Hippo/YAP信号通路。与对照组相比，沉默MST1基因，利拉鲁肽干预组脂肪分化的关键转录因子表达降低，脂滴产生减少。2.与对照组相比，利拉鲁肽可以减轻高脂喂养KKAy小鼠体重，白色脂肪组织细胞染色发现脂滴的生成数量增多，体积变小。利拉鲁肽上调了腹股沟和肾周脂肪组织甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）和激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)，诱导细胞死亡DNA片段化因子α样效应因子（cell death-inducing DNA factor alpha like effector,Cidea）、PPARγ、含PR域家族第16成员（positive regulatory domain containing16，PRDM16）、解偶联蛋白1（uncopling protein1，UCP1）、细胞色素c（cytochrome c，CytoC）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活物1α(peroxisomeproliferator-activa-tedreceptorsγcoactivator1α，PGC1α)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)、细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase IV，COX-IV）的表达。在体外实验3T3-L1细胞诱导成脂分化的过程中，利拉鲁肽同样可以上调以上基因的表达，诱导白色脂肪棕色样变。在体内和体外实验中，与对照组相比，利拉鲁肽上调了sGCβ、蛋白激酶（protein kinase1，PKGI）的表达，sGC激活剂增强了棕色脂肪关键基因和PKGI的表达。 结论：1.利拉鲁肽通过激活Hippo/YAP信号通路，抑制前脂肪细胞3T3-L1的增殖，在成脂诱导分化早期，利拉鲁肽促进3T3-L1细胞的成脂分化，使3T3-L1细胞尽快的分化为成熟的脂肪细胞。2.利拉鲁肽通过激活sGC信号传导通路诱导白色脂肪棕色样变，减轻体重，治疗肥胖症。

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