基于TMT标记联合液相色谱-串联质谱技术关于强直性脊柱炎的血清蛋白质组学研究

摘要

目的： 强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）作为自身免疫性的炎性疾病之一，具有慢性、进行性特点，其以肌腱和韧带附着点的慢性炎症为主要特征性病理改变。并且，AS可引起脊柱骨突、骶髂关节、肌腱端软组织、脊柱旁软组织及外周关节受侵，且同时合并关节外表现。临床及时诊断与治疗能够有效提高AS患者的预后效果，亦能够有效降低致残率，最终有助于促进患者的生活质量的提高。目前有关AS的发病原因尚未定论，既往研究认为其发病机制可能与遗传、免疫和感染等因素密切相关。本研究采用蛋白质组学的理念，通过串联质谱标签（Tandem mass tag，TMT）的方法，并采用液相色谱串联质谱进行分析，筛查并鉴定AS患者血清中具有的且较健康成人和弥漫性特发性骨肥厚症（diffuse idiopathic hyperostosis，DISH）患者的差异表达蛋白质，以期探索AS病理中存在的特异性差异蛋白，寻找早期诊断该病的血清蛋白标记物，同时为深入探讨AS的发病原因、探索临床早期诊断的方法与药物治疗靶点、并且为AS预后评估和易感人群的筛查等方面提供一定的依据。 方法： 1）参照ESSG（1991年）有关AS和ASAS（2009年）有关中轴型SPA（Spondyloarthritis，SPA）的诊断标准，采集6例AS患者、6例DISH患者（根据Resnick诊断标准）与6例年龄相近、性别匹配的正常人的空腹静脉血，于4℃下经低温离心处理，收集上层血清，并进行分装标识，将其置于-80℃环境下进行留存待测。将全部上层血清弃去高丰度蛋白，采取SDS-PAGE；接着采用蛋白胶内酶解，用胰蛋白酶（Trypsin）消化蛋白，获取肽段，通过TMT对其进行标记。其中，分为对照组（用TMT6-127标记），AS组（用TMT6-129标记），DISH组（用TMT6-131标记）。肽段标记完毕后，进行充分混合，并进行除杂质除盐处理，最后液相色谱-串联质谱联用的检测分析则在纳升液相色谱仪与质谱仪上进行。根据SEQUEST HT检索算法，并在Swissprot Human数据库上进行谱图检索。搜库软件为Proteome Discoverer，通过Xcalibur2.2版软件进行数据处理。肽段的相对定量则按照TMT不同试剂报告离子的相对丰度，同时依据结果计算蛋白的相对定量。若同一蛋白在某一组较其他组的比值（Ratio）变化超过1.5倍，即以Ratio＞1.5表示上调，Ratio＜0.75表示下调，此时具有显著差异。2）采用生物信息学的方法，初步分析所筛选和鉴定的全部差异蛋白，分析差异蛋白的作用机制，从而推断其在生物网络中的作用和关系，最终对认为具有意义的蛋白进行判定。 结果： 本实验共鉴定出蛋白质424个，其中达到相对定量标准的蛋白数为144个，采用两个及以上特有肽段进行定量的蛋白数61个，采用一个特有肽段进行定量的蛋白数为15个，相对健康对照组共有22个上调蛋白，42个下调蛋白；相对DISH组共有21个上调蛋白，24个下调蛋白。 结论： 1、本实验根据TMT标记蛋白定量技术，并进行液相色谱串联质谱分析，对AS患者血清相对于健康对照组与DISH组进行差异蛋白质组学研究，探究且建立AS患者血清TMT液相色谱串联质谱实验研究的技术框架。 2、初步分析AS的特异血清标记物及其发病原因，由此设计患者血清差异蛋白质组的数据库，探索其血清中较健康群体和DISH患者出现明显改变的可定量蛋白。 3、基于本实验，在蛋白质组学研究的同时，初步进行所筛出蛋白的生物信息学研究，试图找到一些潜在的AS的生物标记物，为深入研究提供一定基础。

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