甲磺酸萘莫司他修复脊髓损伤的实验研究

摘要

目的： 脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是一种严重的中枢神经创伤性疾病，往往会导致严重的神经损伤，且目前尚无有效治疗策略。脊髓损伤后，局部微环境失衡，引发瀑布式的炎症反应。丝氨酸蛋白酶，如凝血酶、类胰蛋白酶等在脊髓损伤发生后表达显著增强，并通过蛋白酶激活受体而激活下游一系列相关信号通路而介导炎症、凋亡反应，产生神经痛。通过研究增加现有临床药物修复脊髓损伤的新的适应证，将大大加快药物的转化应用。甲磺酸萘莫司他（Nafamostat Mesilate，NM）作为一种人工合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂，已被临床应用于急性胰腺炎等疾病的治疗。然而，甲磺酸萘莫司他对于脊髓损伤的干预效果尚不清楚。本研究旨在探讨甲磺酸萘莫司他在改善脊髓损伤中的修复作用及其相关机制，为SCI提供新的修复策略。 方法： 1.建立脊髓损伤模型：应用IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓损伤打击器建立脊髓挫伤模型，打击重锤质量为10g，打击高度为25mm。 2.实验分组：雌性Wistar大鼠(240±10g)，10周龄，随机分为3组：（1）假手术组（Sham）组，即只咬除T10椎板；（2）单纯损伤（Injury）组；（3）甲磺酸萘莫司他干预（NM）组。 3.甲磺酸萘莫司他干预后组织学观察及行为学评价：损伤后3天及8周两个时间点应用苏木精-伊红染色（HE染色）和Luxol fast blue（LFB）染色，据此观察脊髓组织改变及甲磺酸萘莫司他干预效果。行为学评价包括8周内通过BBB评分及斜板实验评估大鼠后肢运动功能恢复情况。 4.甲磺酸萘莫司他修复脊髓损伤的作用机制：酶联免疫吸附（ELISA）技术检测各组大鼠脑脊液及脊髓组织中炎症因子IL-6及TNF-α的浓度，同时通过蛋白印迹（Western blot）技术观察凝血酶（Thrombin）表达，免疫荧光CD68染色检测SCI后炎症细胞—小胶质细胞/巨噬细胞的趋化作用，GFAP免疫荧光染色观察星形胶质细胞的活化状态，应用TUNEL及Annexin-V/Propidium Iodide（AV/PI）流式细胞检测细胞凋亡，通过Western blot技术检测各组凋亡相关蛋白Caspase-3及Bcl-2的表达以及神经营养因子BDNF，NGF及NT-3的表达，实验数据进行相应统计学分析。通过该研究探讨甲磺酸萘莫司他干预对脊髓损伤后炎症、凋亡反应及神经保护方面的作用。 结果： 1.干预后组织学观察：HE结果显示，与Injury组相比，甲磺酸萘莫司他干预可显著改善SCI早期的损伤区域面积以及慢性期的空洞形成；LFB染色结果显示甲磺酸萘莫司他组具有更大的LFB阳性区域，表明甲磺酸萘莫司他具有减轻脱髓鞘的作用。 2.行为学评价：通过BBB评分及斜板实验评估大鼠后肢运动功能恢复情况，脊髓损伤后8周内进行行为学评分，BBB评分及斜板实验结果均显示，与Injury组相比，甲磺酸萘莫司他干预可改善大鼠行为学功能评分，差异具有统计学意义。 3.改善损伤后微环境 3.1甲磺酸萘莫司他减轻脊髓损伤后的炎症反应及Thrombin的表达：ELISA结果显示与Injury组相比，甲磺酸萘莫司他干预明显降低大鼠脑脊液及脊髓组织中炎症因子IL-6及TNF-α表达（p＜0.01），western blot结果表明甲磺酸萘莫司他可显著抑制Thrombin的表达（p＜0.01）；CD68免疫荧光染色结果显示甲磺酸萘莫司他组中CD68阳性细胞数目明显减少，差异具有统计学意义（p＜0.01）。 3.2甲磺酸萘莫司他减轻脊髓损伤后的凋亡反应：TUNEL及AV/PI流式细胞结果显示甲磺酸萘莫司他组凋亡细胞数量明显少于Injury组，差异具有统计学意义（p＜0.01）；Western blot结果显示甲磺酸萘莫司他可降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达，增强抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，差异具有统计学差异（p＜0.01）。 3.3甲磺酸萘莫司他增强脊髓损伤后营养因子的表达，包括BDNF，NGF以及NT-3，差异具有统计学意义（p＜0.05）。 结论： 1.本实验证实甲磺酸萘莫司他能够显著减轻脊髓损伤后组织损伤，促进大鼠行为学功能恢复。 2.甲磺酸萘莫司他通过改善脊髓损伤后局部微环境，包括减轻炎症反应，抑制凋亡及提高神经营养因子表达实现修复作用。 3.本课题为甲磺酸萘莫司他促进中枢神经系统的再生修复提供实验依据，并为脊髓损伤修复提供一种新策略。

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