聚噻吩纳米粒子的制备与pH传感及细胞成像研究

摘要

细胞内pH值（pHi）在许多生理和病理过程中扮演着非常重要的角色。典型的哺乳类动物细胞内pH值在4.5-8.0范围内，而不同细胞器内pH值又有所不同，例如细胞质基质中pHi通常在6.8-7.4，而溶酶体、线粒体中pH值则分别约为4.5和8.0。轻微的pHi值变化可以反映出细胞的状态和代谢过程。此外，大量的研究已经表明，细胞的高酸度往往与许多疾病相关。因此，细胞内pH值的准确测量和可视化成像对生物学研究和临床诊断具有重要意义。 荧光探针技术具有灵敏度高，操作简单，信噪比高，良好的时空分辨率等优势，已经成为细胞内pH值测定的有效分析手段之一。目前已有大量的pH荧光探针被报道了，这些探针主要基于小分子荧光染料如荧光素、花菁和芘等的衍生物。这些探针通常存在水溶性差、光稳定性差的缺点，无法对细胞内pH值的变化进行长时间的追踪和观察。因此发展其它的pH探针体系是非常必要的。 共轭聚合物具有强的光捕获能力和倍增光学响应性，为各种生物活性物质的传感和成像提供了新的材料体系。本论文设计合成了一种聚噻吩衍生物（PTNEt2），其结构特征在于聚噻吩骨架为荧光报告基团，侧链二乙氨基为pH响应性基团。该聚合物几乎不溶于水，但其质子化的产物易溶于水。利用这一性质，一种新颖的基于pH依赖性的共轭聚合物纳米粒子组装-解组装pH传感策略被提出了，其pH检测原理如下：分散在水中的PTNEt2纳米粒子（PTNPs）由于聚集诱导的荧光淬灭，其溶液几乎不发射荧光。随着pH的降低，PTNPs中的PTNEt2上的二乙氨基被质子化，聚合物链间由于静电斥力而使纳米粒子解组装，体系的荧光恢复。相反，随着pH的升高，PTNEt2上的二乙氨基去质子化，变为非水溶性的聚合物，而重新组装成纳米粒子，体系的荧光淬灭。本论文的主要工作如下： （1）共轭聚合物纳米粒子PTNPs的制备及其稳定性研究。 ①首先合成了共轭聚合物PTNEt2，利用NMR确定了其化学结构。②然后，利用再沉淀方法制备了PTNEt2纳米粒子（PTNPs），采用TEM，DLS分别表征了纳米粒子的形貌和水合直径，考察了聚合物浓度对纳米粒子粒径和形貌的影响。结果表明：聚合物形成了类球形的纳米粒子，随着聚合物浓度的增加，纳米粒子粒径增加，稳定性减弱。聚合物浓度为1mg/mL制得的聚合物纳米粒子稳定性较好，浓度适宜，其水合直径约为193nm。③最后，利用动态光散射（DLS），系统研究了静置时间、pH值、细胞中常见生物活性物质等因素对纳米粒子稳定性的影响。 （2）纳米粒子PTNPs对pH的响应性及细胞成像。 利用紫外吸收光谱、荧光发射光谱详细研究了纳米粒子PTNPs对pH的响应性。将纳米粒子分散在pH=8.0的水溶液中，逐渐向该溶液中加入0.1M乙酸，使体系的pH逐渐降低到4.0。紫外滴定光谱结果表明，随着体系酸度的增强，紫外光谱中约515nm，550nm，595nm处纳米粒子的聚集特征吸收峰逐渐蓝移到约438nm，溶液颜色由紫色逐渐变为淡黄色。而其荧光发射光谱则表明：随着体系pH值的降低，荧光强度逐渐增加。根据荧光强度随pH值变化的关系曲线，可得纳米粒子的pKa约为5.71（R2为0.9979）。当在pH=4.0的体系中逐渐加入0.1M Na2CO3水溶液，使体系的pH值逐渐恢复到8.0，光谱滴定结果如下：随着体系碱度逐渐增强，溶液的荧光强度逐渐减弱，而约438nm处的紫外吸收峰则逐渐红移到约515nm，550nm，595nm。与其它金属离子相比，只有H+的加入引起了PTNPs显著的荧光强度变化，证明了PTNPs对pH具有良好的选择性。 MTT实验结果表明PTNPs的细胞毒性低，显示出良好的生物相容性。pH值依赖性的细胞成像实验表明，纳米粒子的荧光强度与细胞内pH值的变化呈良好的线性关系（Y=2.4506-0.3077X,R2=0.9966)。因此PTNPs有望用于细胞内pH的定量检测。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 基于有机小分子染料的pH探针

1.3 基于无机量子点的pH探针

1.4 基于共轭聚合物的pH探针

1.5 基于共轭聚合物纳米粒子的pH探针

1.5.1 共轭聚合物纳米材料的制备

1.5.2 基于光诱导电子转移（PET）效应的pH响应型纳米粒子探针

1.5.3 基于荧光共振能量转移（FRET）效应的pH响应型纳米粒子探针

1.5.4 基于自聚集相关能量转移（SAET）效应的pH响应型纳米粒子探针

1.6 本课题的提出及主要内容

1.6.1 课题的提出及创新点

1.6.2 主要内容的研究

第二章 共轭聚合物纳米粒子PTNPs的制备及其稳定性研究

2.1 试剂与仪器

2.1.1 主要试剂

2.1.2 实验仪器

2.2 实验部分

（1）化合物2的合成

（2）化合物3的合成

（3）聚合物PTNEt2的合成

2.3 纳米粒子的制备及表征

2.3.1 PTNEt2纳米粒子的制备及表征

2.3.2 聚合物浓度对纳米粒子尺寸和稳定性影响

2.4 纳米粒子稳定性研究

2.4.1 静置时间对纳米粒子尺寸和稳定性的影响

2.4.2 pH值对纳米粒子尺寸和稳定性的影响

2.4.3 生物活性物质对纳米粒子尺寸和稳定性的影响

2.5 本章小结

第三章 纳米粒子PTNPs对pH的响应性及细胞成像

3.1 共轭聚合物纳米粒子对pH值的滴定光谱（pH=8.0-4.0）

3.1.1 紫外滴定光谱

3.1.2 荧光滴定光谱

3.2 共轭聚合物纳米粒子对pH值的滴定光谱（pH=4.0-8.0）

3.2.1 紫外滴定光谱

3.2.2 荧光滴定光谱

3.3 选择性研究

3.4 pH值对光谱稳定性的影响

3.5 细胞成像

3.5.1 纳米粒子的细胞毒性研究

3.5.2 细胞成像

3.5.3 细胞器定位实验

3.5.4 pH依赖性的细胞成像

3.6 本章小结

第四章 全文总结

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢