蛋白质拼接法制备片段同位素标记ApoE及RAP结构的初步研究

摘要

ApoE是一种阿朴质蛋白，它有299个氨基酸。它可以同LDL受体蛋白、肝素以及磷酯相结合，其主要的生理功能是调节体内磷酯的代谢。它同第三类高酯血、动脉硬化及老年痴呆病相关。了解apoE的结构以及其在体内的分子生物学过程，可提高人类对这些疾病的预防以及治疗的水平。ApoE氨基端(1—199)的结构已用X-Ray法进行了测定，而apoE羧酸端及整个分子的结构依然未知。由于apoE蛋白质分子量较大，NMR信号重叠较多，不利于结构的解析以及片段相互作用的研究。我们拟利用INTEIN媒介蛋白质拼接方法，制备部分同位素标记的apoE，降低NMR结构解析的难度。受体相关蛋白(RAP)是一种LDL受体折叠的伴侣蛋白，它由323个氨基酸组成，同apoE一样，可以同LDL受体蛋白结合，两者之间有一定的相似性。本文着重研究了利用INTEIN媒介蛋白质拼接法制备apoE，并对RAP及各片段性质进行了初步的研究。 ㈠在使用蛋白质拼接法制备部分同位素标记apoE的过程中，详细研究了相关蛋白的制备及拼接反应的条件，产物的纯化。在制备羧酸端的过程中，使用三种不同的方法：直接法制备，使用CNBr切断法以及凝血因子Xa酶切方法，经比较发现凝血因子Xa酶切法无论时收率还是稳定性方面均较成功，但该方法的缺点是存在非特异性的酶切位点；在对apoE氨基端研究过程中，发现使用碱性的培养介质可提高蛋白质的表达收率，使用简单含巯基的化合物进行硫醇解后所得产物会发生水解，无法用于下步的反应；在比较了不同的蛋白质拼接方法后，发现使用INTEIN媒介的蛋白质拼接法可以得到较好的效果；使用优化后的反应条件，第一次大量地制备了部分片段同位素标记的apoE，并进行了NMR测定，得到了简化了的NMR谱图。为进一步使用NMR研究apoE的结构提供了可能。本方法对于制备其它部分同位素标记的蛋白质有借鉴意义。 ㈡针对在使用pTYB1表达载体表达蛋白质的过程中出现的自裂解现象，进行了比较分析，有针对性提出的解决方案。所得到的两种变异体可以部分或几乎完全禁阻自裂解。所使用的方法具有通用性，完全可应于其它的蛋白质的表达过程。 ㈢使用蛋白质交联反应，脂结合能力测定及CD等手段，对RAP及其片段的热力学性质进行了初步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 国内外研究进展

1.1 ApoE研究进展

1.1.1 ApoE的结构

1.1.2 ApoE与脂蛋白的代谢

1.1.3 ApoE与磷脂水平的变化

1.1.4 ApoE2与第三类高脂血病

1.1.5 ApoE4与心脏病

1.1.6ApoE与动脉硬化

1.1.7 ApoE对神经突的伸展调节

1.1.8 ApoE，Aβ和AD

1.2蛋白质的来源

1.3蛋白质化学合成

1.3.1蛋白质的化学合成

1.3.2氨基酸的保护策略

1.3.3氨基酸的连接方法

1.3.4固相多肽合成(SPPS)

1.3.5蛋白质的连接(Protein ligation)

1.3.6蛋白质的天然化学连接

1.4从基因到蛋白质

1.4.1基因重组

1.4.2表达体系

1.4.3表达载体的要素

1.4.4常用的表达载体

1.4.5不常用的编码子

1.4.6蛋白质的稳定性，N-端规则及氨基肽酶

1.5融合蛋白质及标记物去除方法

1.5.1融合蛋白质

1.5.2标记物的作用

1.5.3融合蛋白质的标记物

1.5.4标记物的去除方法

1.6 Intein及相关蛋白质

1.6.1 Intein的起源，分布及相关的蛋白质

1.6.2结构与机理

1.6.3交叉拼接

1.6.4 Intein应用

1.7 RAP研究进展

1.7.1 RAP是存在于ER的LDL受体家族的伴侣蛋白

1.7.2 RAP的结构特征

1.8小结

第二章 实验部分

2.1仪器及试剂

2.2在实验过程中的涉及的蛋白质的命名及说明

2.3操作过程

2.3.1表达质粒体的构建及变异

2.3.2蛋白质的表达

2.3.3同位素标记的蛋白质的制备

2.3.4蛋白质的纯化过程

2.3.5凝血因子Xa酶切

2.3.6溴化氰切断蛋白质

2.3.7蛋白质的拼接与纯化

2.3.8蛋白质结合脂能力(Lipid binding assay)的测定

2.3.9圆二色光谱(Circular dichroism spectroscopy)的应用

2.3.10蛋白质的交联反应

第三章 结果与讨论

3.1利用蛋白质拼接法制备ApoE

3.1.1蛋白质拼接的策略

3.1.2ApoE羧酸端及相关的蛋白质

3.1.3ApoE氨基端及相关的蛋白质

3.1.4利用蛋白质拼接法制备ApoE及片段同位素标记的apoE

3.2 pTWIN1的变异及自裂解的禁阻

3.2.1假设及引物设计

3.2.2实验结果

3.2.3小结

3.3 RAP蛋白质结构的初步研究

3.3.1 RAP及相其相关片段的表达

3.3.2 RAP及其片段的凝血因子Xa酶切

3.3.3 RAP的功能片段结构

3.3.4 RAP的自结合实验(交联实验，cross-linking)

3.3.5 RAP的功能片段3的易变性

3.3.6 RAP的脂结合实验

3.3.7小结

第四章 结论与意义

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢