Afr1介导的酵母信息素通路与细胞壁完整性通路间的对话

摘要

信息素信号通路和细胞壁完整性通路是酵母细胞中两条比较重要的MAP(Mitogen activated protein)激酶信号转导通路,它们之间具有很重要的对话作用。Afrl在这两条信号通路的对话中具有极其重要的作用,因为它能够同时受到两条信号通路转录因子Ste12和Rlm1的转录激活。
　　 通过基因组文库筛选技术,发现酵母细胞的AFR1基因同BCK1具有重要的遗传关系,通过进一步的研究发现,AFR1同细胞壁完整性通路中的大部分组件都有类似于BCK1的遗传关系。本论文主要从Afr1的两个重要功能即过量表达使细胞具有α-factor抗性及改变细胞形态入手,分别研究Afr1与细胞壁完整性通路的相互作用。
　　 通过经典的α-factor抗性实验发现,Afrl在信息素信号通路中具有完全不同于Sst2的作用机制,过量表达Afr1使细胞产生的a-factor抗性依赖于Mpk1,而Mpk1对于过量表达Sst2产生的α-factor抗性并不重要。通过Western实验发现,Afr1对于Mpk1的活性具有一种正调控作用,它的缺失或过量表达能降低或提高Mpk1的磷酸化水平。另外,实验还发现,Afr1只是在Mpk1磷酸化水平的改变过程中起到一种辅助作用,单纯地改变Afr1的表达量并不能明显影响Mpk1的活性。
　　 有丝分裂期过量表达Afr1能改变细胞的形态,但是在Pkc1/Mpk1组件缺失的菌株中,过量表达Afr1导致细胞表现出合成致死性。通过对这种致死性进行大量的研究发现,它具有非常复杂的调控机制。目前还难以做出合理的解释。
　　 本论文研究发现,Afr1不仅受到信息素的诱导表达,它还能在有丝分裂期被Mpk1诱导激活,并且这种有丝分裂期的表达水平甚至高过信息素诱导的表达水平。此外,实验还发现,AFR1启动子序列的PRE和Rlm1响应元件对于它的α-factor抗性功能同等重要。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 文献综述

1.1 G蛋白偶联的跨膜信号转导通路

1.1.1 G蛋白偶联受体

1.1.2 MAP激酶调控GPCR信号转导

1.2 酿酒酵母信息素信号转导通路

1.2.1 信息素信号转导通路

1.2.2 信息素通路G蛋白的效应物

1.2.3 信息素通路的MAP激酶级联反应

1.2.4 信息素通路MAP激酶的作用靶点

1.2.5 信息素信号转导通路的调控

1.3 酿酒酵母细胞壁完整性信号通路

1.3.1 细胞表面受体Wscl-Wsc3、Mid2和Mtl1

1.3.2 CWI信号通路中的G蛋白Rho1

1.3.3 Rho1的效应物Pkc1

1.3.4 Mpk1的细胞核靶点

1.3.5 Mpk1的细胞质靶点

1.3.6 CWI信号通路的激活

1.3.7 CWI信号通路的平行信号转导通路

1.4 信息素通路与CWI信号通路的对话作用[113,138]

1.5 Afr1的功能与作用

1.6 本论文研究的目的和意义

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 质粒、菌株和引物

2.1.2 主要实验仪器

2.1.3 主要试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 主要溶液

2.2 实验方法

2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法(CTAB法)

2.2.3 DNA的限制酶消化

2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.2.5 从琼脂糖中回收DNA

2.2.6 DNA的连接反应

2.2.7 PCR扩增反应

2.2.8 酵母细胞的转化方法

2.2.9 酵母中质粒的回收

2.2.10 不同交配型酵母细胞之间的杂交

2.2.11 产孢及四分体孢子拆分

2.2.12 酵母交配型的验证

2.2.13 酵母EMS诱变

2.2.14 一步基因置换法缺失目的基因

2.2.15 融合PCR

2.2.16 Halo实验方法

2.2.17 Dilution实验方法

2.2.18 酵母蛋白质的提取

2.2.19 蛋白质浓度的定量(Bio-Rad方法)

2.2.20 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备

2.2.21 Western blot蛋白免疫实验

2.2.21 质粒缺口修复(Gap-Repair)

第三章 过量表达Afr1所产生的α-factor抗性依赖于Mpk1

3.1 实验结果与讨论

3.1.1 Afr1的定位

3.1.2 BCK1基因的筛选分离

3.1.3 bckl△和mpk1△突变株的构建

3.1.4 afr1△对W310和W320突变株的生长影响

3.1.5 bck1△和mpk1△突变株的suppressor生长现象

3.1.6 afr1△W310和W320突变株的细胞形态影响

3.1.7 afr1△对W310和W320突变株α-factor抗性的影响

3.1.8 过量表达Afr1对W310和W320突变株α-factor抗性的影响

3.1.9 α-factor诱导下Afr1的表达

3.1.10 Afr1对Mpk1磷酸化水平的影响

3.2 小结

第四章 过量表达Afr1与Pkc1/Mpk1组件缺失的合成致死研究

4.1 实验结果与讨论

4.1.1 过量表达Afr1所引起的长芽形态研究

4.1.2 过量表达Afr1与CWI信号通路组件的合成致死现象

4.1.3 过量表达Afr1引起的合成致死与细胞形态的关系

4.1.4 同时与Afr1和Mpk1具有相互作用蛋白的研究

4.1.5 与bck1和mpk1成致死基因的研究

4.1.6 Afr1在Mih1参与的G2/M通路中的作用

4.2 小结

第五章 酿酒酵母细胞中Afr1的表达研究

5.1 实验结果与讨论

5.1.1 α-factor诱导下W308和W320细胞中Afr1的表达

5.1.2 有丝分裂期W303和W218细胞中Afr1的表达

5.1.3 Afr1在两种不同诱导条件的表达量比较

5.1.4 不同AFR1启动子对细胞α-factor抗性的影响

5.1.5 Afr1在有丝分裂期的表达对细胞形态的影响

5.2 小结

第六章 总结与展望

6.1 主要创造性工作总结

6.2 相关工作的前景展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文和参加科研情况

附录1 生化名词缩写

致谢