乳酸片球菌16SrRNA基因和片球菌素基因的克隆及序列分析

摘要

细菌素是乳酸菌产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，有作为安全高效食品防腐剂的良好应用前景。本试验对以往从发酵食品中分离出的一株乳酸菌进行了鉴定，用生理生化试验确认其为乳酸片球菌，并发现该菌株具有杀死单核细胞增多症李氏杆菌的作用。经蛋白水解酶试验、对过氧化氢酶试验、有机酸排除试验等认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽，即细菌素。根据GenBank,(X95976)公布发表的Pediococcus acid 16SrRNA基因序列，设计并合成一对特异引物，采用PCR技术，扩增出16SrRNA片段，并将该片段定向克隆于克隆测序pUCm-T载体上。经PCR、限制性内切酶酶切验证筛选，最后对阳性的转化子提取质粒进行DNA序列的测定与分析，同源性为99％，进一步从基因分子水平鉴定了分离株为乳酸片球菌。 为了探索乳酸片球菌的抗菌机理，从分子水平检测是否有片球菌素操纵子的存在，本试验根据GenBank(Accession number M83924)公布发表的Pediococcusacid结构基因序列，设计合成了3对特异引物，采用PCR技术，扩增出目的片断，并将片段定向克隆于克隆测序pTA2载体上。经PCR、限制性内切酶酶切验证筛选，最后对鉴定为阳性的转化子提取质粒进行DNA序列的测定与分析，发现该乳酸片球菌素操纵子大小为5595bp，含有4个主要的基因，分别是PedA、PedB、PedC、和PedD基因，与GenBank发表的乳酸片球菌操纵子基因相比同源性达到99.9％，在第1688个碱基变异，导致PedC基因一个氨基酸的改变，这就从分子水平说明了该菌抗菌活性是由操纵子基因编码实现的。 经试验发现，我们分离的乳酸片球菌细菌素产量较低，不适合进行产业化开发。本试验提取乳酸片球菌的全基因组作为模版，根据GenBank(M83924)发布的pediocin PA-1结构基因序列设计合成一对特异引物，采用PCR技术，从基因组DNA中扩增出目的片段，并将该片段定向克隆于克隆测序载体上。经验证筛选，最后对鉴定为阳性的转化子进行核苷酸序列测定与分析，然后克隆到表达载体pET-28a，转化E.coliDH5α，经过kana+平皿筛选，质粒酶切，PCR两步验证，获得阳性重组质粒，并转化表达宿主菌E.coli BL21，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳，显示在4600Da左右出现条带，与已预期的细菌素分子量大小符合。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

第一章文献综述

1.1乳酸菌及乳酸片球菌的分类

1.1.1乳酸菌的分类位置及现有种属

1.1.2乳酸菌的鉴定

1.1.3 16SrRNA和乳酸菌分子生物学

1.1.4乳酸片球菌种属分类位置

1.1.5片球菌属的特征

1.1.6片球菌属的分类

1.2乳酸菌细菌素的研究

1.2.1乳酸菌的调节作用

1.2.2细菌素的研究

1.2.3乳酸菌的细菌素研究概况

1.2.4细菌素的分类

1.2.5细菌素的生物学特性

1.2.6细菌素作用机理

1.2.7细菌素在食品工业中的应用

1.3乳酸片球菌基因分子水平研究

1.3.1片球菌素基因结构模型

1.3.2细菌素生物合成基因

1.3.3片球菌素分泌途径

1.3.4片球菌素的辅助蛋白

1.3.5片球菌素的前导肽

1.3.6片球菌素的结构

1.4乳酸片球菌素的研究现状

1.5立题的意义

第二章16SrRNA鉴定乳酸片球菌分离株

2.1材料与试剂

2.1.1试验药品

2.1.2试验仪器

2.1.3菌株

2.1.4克隆载体

2.1.5试剂和修饰酶类

2.1.6试剂盒

2.1.7主要试剂配制

2.2方法

2.2.1传统分类方法的鉴定

2.2.2菌株特性试验

2.2.3 16SrRNA基因片断的获取

2.2.4特异性检测

2.2.5 16SrRNA基因片断的克隆

2.3结果

2.3.1传统分类方法的鉴定

2.3.2抑菌物质的纯化和定性研究

2.3.3抑菌物质的抗菌活性

2.3.4 16SrRNA序列鉴定菌种

2.4讨论

第三章乳酸片球菌操纵子基因的克隆及核苷酸序列分析

3.1材料和试剂

3.1.1菌种

3.1.2克隆载体

3.1.3试剂和修饰酶类

3.1.4试剂盒

3.1.5试剂配制

3.1.6 PCR引物的设计与合成

3.2方法

3.2.1 P1 P2 P3基因片断的获取

3.2.2目的片断与T载体的连接

3.2.3连接产物转化到DH5a感受态菌

3.2.4转化子的筛选

3.2.5核苷酸序列分析

3.3结果

3.3.1 PCR扩增片球菌操纵子基因

3.3.2转化子的筛选及核苷酸序列测定

3.3.3核苷酸序列分析

3.4.讨论

第四章乳酸片球菌素基因Ped-A的克隆与表达

4.1材料和试剂

4.1.1菌种

4.1.2克隆载体

4.1.3试剂和修饰酶类

4.1.4试剂盒

4.1.5主要试剂配制

4.1.6 PCR引物的设计与合成

4.2方法

4.2.1 Ped-A基因的获取

4.2.2目的片断与T载体的连接

4.2.3重组质粒转化DH5a感受态菌

4.2.4转化子的筛选

4.2.5核苷酸序列分析

4.2.6 Ped-A编码序列原核表达载体的构建

4.2.7原核表达与鉴定

4.3结果

4.3.1 PCR扩增Ped-A基因

4.3.2鉴定测序

4.3.3序列分析

4.3.4片球菌素的表达

4.4.讨论

4.4.1片球菌素克隆表达的意义

4.4.2 PCR技术关键问题

第五章结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致 谢