酿酒酵母Zds1/Sch9在Ras-cAMP信号通路中的功能研究

摘要

Ras/cAMP信号通路中，Sch9/Zds1的功能对调节酵母细胞PKA活性乃至热激抗性以及其调节亚基Bcy1的定位具有重要作用，同时Bcy1的定位也与碳源类型密切相关。研究不同碳源条件下Sch9/Zds1如何共同作用实现对PKA活性以及Bcy1定位的调控，将有助于酿酒酵母信号通路的研究，同时为高等真核生物的信号通路研究提供借鉴。 本研究表明，正常PKA水平的菌株中过量表达ZDS1可使。PKA水平降低，而低PKA表型的菌株中过量表达ZDS1可使PKA水平升高。这说明酵母细胞可能通过Zds1响应不同的PKA表型从而自我调节PKA的水平。 不同碳源条件下，与野生型相比，zds1△突变株和sch9Δ突变株中，Bcy1均由细胞质向细胞核转移。野生型和sch9Δ突变株中过量表达ZDS1可使Bcy1由细胞核向细胞质转移。野生型细胞中过量表达SCH9可使Bcy1由细胞核向细胞质转移，但zds1△突变株中过量表达SCH9不能使Bcy1由细胞核向细胞质转移。这说明Sch9可能作用于Zds1的上游对Bcy1的定位进行调控。 通过比对热激结果与荧光结果，发现两部分结果之间存在着共同的趋势，推测PKA的活性可能与Bcy1的定位之间存在着直接关系。 研究中还发现，部分正在进行出芽生殖过程的细胞中，Zds1在芽颈处大量聚集，而且碳源的差异也没有造成明显的区别。这表明，Zds1可能在酿酒酵母出芽生殖的过程中起着重要的作用。

目录

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前 言

第一章文献综述

1.1 G蛋白与细胞信号转导

1.2 RAS基因及其蛋白产物

1.3 cAMP信号通路的组成及作用

1.4酿酒酵母cAMP信号转导通路

1.4.1 G蛋白偶联的受体体系(Gpr1-Gpa2)

1.4.2 Ras-cAMP信号通路组成

1.4.3 cAMP途径的主要靶标--cAMP依赖的蛋白激酶PKA

1.4.4 PKA调节亚基Bcyl的细胞定位

1.5 FGM信号通路及其主要作用元件

1.5.1 Sch9和PKA的相互作用关系

1.6 cAMP-PKA途径与胁迫响应之间的关系

1.7本研究的目的和内容

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒、菌株与引物

2.1.2主要实验仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4培养基

2.1.5主要溶液

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

2.2.2小规模提取大肠杆菌质粒法(CTAB法)

2.2.3酵母染色体的快速分离

2.2.4 PCR扩增反应

2.2.5 DNA的限制酶消化

2.2.6 DNA的连接反应

2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.2.8从琼脂糖中回收DNA

2.2.9酵母细胞的转化方法

2.2.10 酵母中质粒的回收

2.2.11酵母交配型的验证

2.2.12不同交配型酵母细胞之间的杂交

2.2.13产孢及四分体孢子拆分

2.2.14 Dilution实验方法

2.2.15热击实验方法

第三章结果与讨论

3.1.Zdsl/Sch9对PKA活性表型的影响

3.1.1 SCH9基因的缺失

3.1.2 ZDSl基因的缺失

3.1.3 SCH9和ZDSl基因的双缺失

3.1.4质粒YEplacl95-ZDSl的构建

3.1.5 Zdsl/Sch9对PKA活性表型的协同作用

3.2 Zdsl/Sch9对PKA调节亚基Bcyl定位的调控

3.2.1质粒YEplacl81-SCH9的构建

3.2.2质粒YCplac22-GFP-BCY1的构建

3.2.3质粒YEplacl81-ZDSl-GFP的构建

3.2.4缺失SCH9对Bcyl定位的影响

3.2.5缺失ZDSl对Bcyl定位的影响

3.2.6过量表达SCH9以及过量表达ZDSl对Bcyl定位的影响

3.2.7 SCH9和ZDSl双缺失对Bcyl定位的影响

3.2.8 Zds1在细胞内定位情况的初探

3.3 Bcyl的定位与PKA活性之间的关系推测

第四章总结与展望

4.1主要工作总结

4.2相关工作展望

参考文献

致谢