酿酒酵母TOR/Sch9对Ras-cAMP信号通路的调控研究

摘要

葡萄糖可以诱导解除葡萄糖抑制的酿酒酵母细胞的cAMP水平迅速而短暂升高，并激活PKA，导致经细胞由低PKA表型转向高PKA表型，同时细胞进入发酵生长。氮源、磷酸盐也可以诱导解除氮源、磷酸盐抑制的酿酒酵母细胞的生长，并使PKA调控的稳定期特征迅速消失，细胞迅速由低PKA表型向高PKA表型转变。氮源或磷酸盐激活PKA下游靶标需要葡萄糖的存在。同样，葡萄糖激活PKA下游靶标也需要氮源或磷酸盐的存在。必然存在某个信号转导网络收集来自各种不同营养感知系统的信息并将其整合为一个通用的细胞响应作用于PKA的下游靶标。本研究将探讨氮源通过何种机制调节葡萄糖诱导的cAMP信号。
　　 本研究发现氮源缺乏条件下葡萄糖诱导的cAMP信号消失，雷帕霉素处理后葡萄糖诱导的cAMP信号也消失，而表达具有雷帕霉素抗性的TORl-RR等位基因可以消除雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响。TOR为氮源和雷帕霉素的靶标，雷帕霉素处理使细胞表现出类似氮源缺乏条件下的表型。这说明氮源通过TOR调节葡萄糖诱导的cAMP信号。Sch9是TORCl的主要下游靶标。缺失SCH9后葡萄糖诱导的cAMP信号消失，这说明氮源通过TOR-Sch9调节Ras-cAMP信号通路。
　　 本研究揭示了TOR-Sch9调控Ras-cAMP信号通路的机制。TOR和Sch9对PKA有抑制作用，雷帕霉素处理或缺失SCH9后PKA水平增高，较高PKA条件下Cdc25被PKA的催化亚基超磷酸化，被超磷酸化的Cdc25将从细胞膜上游离而分布于细胞质中，进而拉开了与效应物Ras-Cyrl的距离，并实现对Ras-cAMP信号通路的反馈抑制作用，从而使葡萄糖诱导的cAMP信号消失。
　　 本研究发现Sch9通过调节PKA的调节亚基和催化亚基的细胞定位实现对PKA的调节。缺失SCH9后PKA的调节亚基Bcyl向细胞核转移，而催化亚基Tpkl、Tpk2和Tpk3向细胞质转移，这样更多的催化亚基从调节亚基的抑制中解除出来成为有活性的催化亚基，PKA活性增高。本研究还表明Sch9对Bcyl的磷酸化有调节作用，sch9△突变株中Bcyl的磷酸化明显减弱。
　　 本研究表明Bcyl的细胞定位与碳源，氮源以及PKA水平有关。以葡萄糖为碳源时的对数期细胞中Bcyl主要定位在细胞核中，而稳定期的细胞中或以非发酵碳源为碳源时Bcyl定位在细胞质中的量增多。氮源通过Sch9调节Bcyl的定位。氮源缺乏条件下或缺失SCH9后Bcyl集中在细胞核中。Sch9通过Zdsl调节Bcyl的定位，且Sch9对Zdsl的磷酸化有调节作用。Bcyl的定位还受Yakl、Riml5、Msn2和Msn4的调节。yakl△突变株、riml5△突变株和msn2△msn4△突变株中Bcyl主要定位在细胞核中。PKA水平较高时，Bcyl主要定位在细胞核中，PKA水平较低时，Bcyl定位在细胞质中的量增多。
　　 本研究还发现Sch9对Yakl的定位有调节作用。在以葡萄糖为碳源的对数期野生型细胞中Yakl主要定位在细胞质中，缺失SCH9后Yakl向细胞核转移。定位在细胞核中的Yakl对细胞周期有抑制作用，这可能是sch9△突变株PKA水平较高但却表现出低PKA表型的原因之一。
　　 本研究还表明，缺失RIMl5和GISl对葡萄糖诱导的cAMP信号没有影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1 Ras-cAMP信号通路及其主要作用元件

1.1.1 Ras-cAMP信号通路的主要作用元件

1.1.2 Ras／cAMP／PKA的下游靶标

1.2 FGM信号通路及其主要作用元件

1.3 Sch9和PKA的相互作用关系

1.4 TOR信号通路

1.4.1 TOR的上游调控元件

1.4.2 TOR的下游元件

1.4.3 TOR信号通路与酿酒酵母时序寿命的关系

1.5 TOR信号通路和Ras／PKA信号通路的相互作用关系

1.6 TOR信号通路和FGM信号通路的相互作用关系

1.7本论文的研究思路

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒、菌株与引物

2.1.2主要实验仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4培养基

2.1.5主要溶液

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

2.2.2小规模提取大肠杆菌质粒法(CTAB法)

2.2.3酵母染色体的快速分离

2.2.4 PCR扩增反应

2.2.5 DNA的限制酶消化

2.2.6 DNA的连接反应

2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.2.8从琼脂糖中回收DNA

2.2.9酵母细胞的转化方法

2.2.10质粒缺口修复

2.2.11酵母中质粒的回收

2.2.12酵母交配型的验证

2.2.13不同交配型酵母细胞之间的杂交

2.2.14产孢及四分体孢子拆分

2.2.15 Dilution实验方法

2.2.16水浴热击实验方法

2.2.17 cAMP定量测量

2.2.18蛋白质浓度的定量(Bio-Rad方法)

2.2.19玻璃珠法提取酿酒酵母总蛋白

2.2.20 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备

2.2.21 Western blot蛋白免疫实验

第三章氮源通过TOR调控Ras-cAMP信号通路

3.1本章所用质粒的构建

3.2葡萄糖诱导的cAMP信号需要氮源的存在

3.2雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

3.3表达TOR1-RR等位基因可消除雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

3.4氮源缺乏条件和雷帕霉素对Cdc25磷酸化的影响

3.5本章小结

第四章Sch9对葡萄糖诱导的cAMP信号的调控

4.1本章所用菌种及质粒的构建

4.1.1 SCH9基因的缺失

4.1.2质粒YCplac22-SCH92D3E的构建

4.2缺失SCH9对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

4.3表达SCH92D3E等位基因可减小雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

4.4缺失SCH9使PKA活性增强

4.5 Sch9通过PKA的催化亚基调节Cdc25的磷酸化

4.6本章小结

第五章Rim15和Gis1对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

5.1本章所需菌株的构建

5.1.1 rim15△的构建

5.1.2 gis1△的构建

5.2 Rim15对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

5.3 Gis1对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响

5.4本章小结

第六章Sch9对PKA调节亚基Bcy1的调控作用

6.1菌种及质粒的构建

6.1.1 MSN2基因的缺失

6.1.2 MSN4基因的缺失

6.1.3 ZDS1基因的缺失

6.1.4质粒YCplac22-BCY1-3xHA的构建

6.1.5质粒YCplac22-GFP-BCY1的构建

6.1.6质粒YCplac181-YAK1的构建

6.1.7质粒YCplac22-SCH9—13xMYC和YEplac181-SCH9的构建

6.1.8质粒YEplac195-ZDS1的构建

6.2 Sch9调节Bcy1的定位及磷酸化

6.3氮源缺乏条件下Bcy1的定位

6.4雷帕霉素对Bcy1定位的影响

6.5 Zds1调节Bcy1的定位

6.6 Yak1调节Bcy1的定位及磷酸化

6.7 Msn2、Msn4和Rim15调节Bcy1定位

6.8 Bcy1的定位与PKA水平相关

6.9本章小结

第七章Sch9对PKA催化亚基的调控作用

7.1质粒的构建

7.1.1质粒YCplac22-TPK1-GFP的构建

7.1.2质粒YCplac22-TPK1-3xHA的构建

7.1.3质粒YCplac33-tpk1wl-GFP的构建

7.1.4质粒YCplac22-TPK2-GFP的构建

7.1.5质粒YEplac112-TPK3-GFP的构建

7.2 Sch9调节Tpk1的定位

7.3氮源对Tpk1定位的影响

7.4雷帕霉素对Tpk1定位的影响

7.5 Tpk1的细胞核定位不依赖于Bcy1

7.6 Sch9调节Tpk2的定位

7.7 Sch9调节Tpk3的定位

7.8本章小结

第八章总结与展望

8.1主要工作总结

8.2展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

附录

致谢