天然酚类和蛋白质与ONOO相互作用的体外研究

摘要

过氧化亚硝基（ONOO-）是由机体内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（·O2-）合成的一类氮自由基，可引发机体的损伤。清除过氧化亚硝基，抑制其对蛋白质的硝基化修饰是目前国际研究的热点之一。本文采用HPLC和质谱分析，研究了几种天然酚类对过氧化亚硝基的清除活性与构效关系；采用HPLC／MS／MS、结合Bioworks肽段检索软件，研究了过氧化亚硝基对干扰素和白蛋白的损伤。 咖啡酸及其衍生物是水溶性抗氧化剂，具有明显清除ONOO-的活性，清除能力由高到低依次为：丹酚酸B（27.55±0.13μM）>迷迭香酸（37.68±0.22μM）>咖啡酸（39.60±0.41μM）>阿魏酸（45.05±0.57μM）>丹参素钠（51.51±1.02μM）>trolox（85.44±1.68μM）。4-酚羟基是活性必需基团，同时3，4-邻二酚羟基、丙烯酸侧链是活性增强基团，且3，4-邻二酚羟基数目与活性成正比。白藜芦醇和虎杖苷是一类脂溶性抗氧化剂，它们清除ONOO-能力由高到低依次为：白藜芦醇（48.34±0.97μM）>虎杖苷（74.69±1.49μM）>trolox（105.40±1.16μM）。质谱分析表明，阿魏酸、白藜芦醇清除ONOO-作用是通过硝化反应机理。 ONOO-能损伤白蛋白和干扰素等蛋白质，损伤程度与ONOO-浓度成正比。ONOO-对人干扰素损伤位点在A螺旋上Met16发生氧化，近E螺旋上Tyr135发生硝化，还有一个位于E螺旋上的疑似硝化位点W140。这几个位点氧化和硝基化修饰将对干扰素活性产生影响。 ONOO-诱发机体内蛋白的氧化／硝化修饰而活性降低或失活，而天然酚类化合物是一类良好的ONOO-清除剂。本文的结果为进一步研究ONOO-清除剂类药物，保护机体免受自由基损伤奠定一定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1过氧化亚硝基

1.1.1过氧化亚硝基

1.1.2过氧化亚硝基合成途径

1.1.3过氧化亚硝基的损伤作用

1.1.4 RNS/ROS/HOCI生物损伤体系

1.2天然酚类抗氧化剂清除ONOO-的机理

1.2.1酚类化合物与ONOO-直接作用的硝化位点取向

1.2.2酚类化合物清除ONOO-的作用机理

1.2.3量子化学法研究酚类清除ONOO-活性-结构关系

1.3酚类抗氧化剂

1.3.1咖啡酸类化合物

1.3.2白藜芦醇与虎杖苷

1.4重组干扰素

1.4.1干扰素分类以及IFN-α2b结构特点

1.4.2干扰素生物学活性

1.5本文主要内容和研究意义

第二章咖啡酸类清除ONOO-的活性和构效关系

2.1材料与方法

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器

2.1.3 ONOO-的合成

2.1.4 ONOO-的鉴定与分析

2.1.5酪氨酸与ONOO-的作用

2.1.6 3-硝基酪氨酸标准曲线

2.1.7高效液相法测抗氧化剂清除ONOO-的活性

2.1.8 IC50的计算

2.1.9咖啡酸类与ONOO-的直接作用

2.1.10阿魏酸与ONOO-作用产物的质谱分析

2.1.11统计分析

2.2结果与讨论

2.2.1 ONOO-的紫外光谱特性

2.2.2 3-硝基酪氨酸的紫外光谱特性

2.2.3 3-硝基酪氨酸的标准曲线

2.2.4咖啡酸类化合物清除ONOO-的活性

2.2.5咖啡酸类化合物清除ONOO-的S曲线拟和与IC50值

2.2.6咖啡酸类化合物与ONOO-作用产物的紫外光谱特性

2.2.7阿魏酸与ONOO-作用后硝化产物的质谱特性

2.3小结

第三章白藜芦醇与虎杖苷清除ONOO-的活性

3.1材料与方法

3.1.1主要试剂

3.1.2主要仪器

3.1.3 ONOO-的合成

3.1.4金属离子对ONOO-的清除作用

3.1.5有机溶剂对ONOO-的清除作用

3.1.6紫外分光法测定tyrosine损伤产物3-NT

3.1.7荧光分光法测定tyrosine损伤产物dityrosine

3.1.8高效液相法测白藜芦醇/虎杖苷清除ONOO-的活性

3.1.9 1C50计算

3.1.10白藜芦醇/虎杖苷与ONOO-的直接作用

3.1.11白藜芦醇与ONOO-作用产物的质谱分析

3.1.12统计分析

3.2结果与讨论

3.2.1金属离子对ONOO-损伤tyrosine的影响

3.2.2有机溶剂对ONOO-损伤tyrosine的影响

3.2.3 ONOO-损伤tyrosine生成3-NT/dityrosine的浓度效应

3.2.4白藜芦醇/虎杖苷清除ONOO-的活性

3.2.5白藜芦醇/虎杖苷清除ONOO-的S曲线拟和与IC50值

3.2.6白藜芦醇/虎杖苷与ONOO-直接作用的紫外光谱特性

3.2.7白藜芦醇与ONOO-生成硝化产物的质谱特性

3.3小结

第四章人干扰素与ONOO-作用的氨基酸损伤位点

4.1材料与方法

4.1.1主要试剂

4.1.2实验中所用溶液的配制

4.1.3主要仪器

4.1.4蛋白样品制备

4.1.5肽段的色谱分离及质谱检测

4.1.6蛋白肽段的鉴定与分析

4.2结果与讨论

4.2.1 ONOO-损伤蛋白样的HPLC-MS及HPLC-MS/MS图谱

4.2.2 ONOO-引发的IFN损伤的氨基酸位点

4.2.3 ONOO-引发的发生氧化/硝化修饰肽段的分析

4.3小 结

第五章ONOO-与白蛋白作用的初步研究

5.1材料与方法

5.1.1主要试剂

5.1.2实验中所用溶液的配制

5.1.3主要仪器

5.1.4 BSA的硝化损伤

5.1.5非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与图像分析

5.1.6用Sephadex G75分离BSA

5.1.7统计分析

5.2结果与讨论

5.2.1 ONOO-诱导BSA硝化损伤

5.2.2 BSA的硝化损伤

5.2.3阿魏酸对ONOO-引起蛋白硝化的影响

5.3小结

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致 谢