新型多药耐药逆转剂的发现及功能评价

摘要

多药耐药(MDR,multidrug resistance)是目前癌症化疗失败最主要的因为。而最为人所熟知的多药耐药机制是癌细胞表面过表达的药物外排泵将其底物抗肿瘤药排出胞外,从而降低药物在细胞内的积累。P-糖蛋白(Pgp／MDR1／ABCB1,P-glycoprotein)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)这两种蛋白是ABC转运体家族成员,行使依赖于ATP水解供能的药物外排功能。PgP和BCRP均可转运多种药物形成多药耐药并伴随药物动力学改变。目前一种最主要的克服多药耐药的方法是抑制转运体的外排作用。一些ABC转运体的抑制剂(化疗增敏剂)已经开发出来,但细胞毒效应及药代动力学方面的副作用阻碍了它们在临床上的应用。潜在的新高效逆转剂开发研究已十分紧迫。
　　 目的:发现能够抑制P-糖蛋白和BCRP外排作用的全新机构的先导化合物,并对这些抑制剂作用于这两种的转运体蛋白的机制进行探讨。
　　 方法:选用PgP过表达的细胞系K562／A02和MCF-7／ADR和BCRP过表达的细胞系HEK-293／BCRP和MCF-7／MX作为多药耐药逆转剂的体外筛选模型。根据数据库提供的包含近约200,000个可商业购买的有机小分子化合物(www.spec.net)进行分子结构多样性分析。再依据聚类分析,经过基于物理化学特性预测、化学稳定性、潜在毒性和代谢的类药性分析,挑选了187个代表性化合物作为生物学检测的备选化合物。这187种化合物(编号C71-C196,C1-C61)首先经过流式细胞技术初筛选具有潜在抑制功能的备选个体,再经过荧光底物(包括罗丹明123、阿霉素、米托蒽醌)外排的抑制鉴定、mRNA及蛋白表达的检测,细胞毒增敏和ATP水解酶活性的检测进行评价。
　　 结果:成功建立了靶向Pgp和BCRP的逆转剂的筛选评价模型。基于上述系统筛选得到的C95号是安全有效的Pgp逆转剂(由罗丹明123外排实验和细胞毒实验得到),并好于阳性对照维拉帕米。RT-PCR和Western Blot实验表明它对细胞Pgp表达无影响,并且是Pgp抑制剂非底物。C84,C130,C138,C145,C188,C53,C55在功能试验都表现出对BCRP较高的逆转活性,在细胞毒实验中普遍好于阳性对照FTC,其中C130,、C53、C55的作用最为突出。
　　 结论:C95是理想的Pgp逆转剂的先导化合物。一系列化合物对BCRP有较高逆转活性,C130、C53和C55尤为突出。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 PgP的结构与功能

1.1.1 概述

1.1.2 PgP结构及外排机制

1.1.3 PgP的生物学意义

1.2 针对PgP的耐药逆转策略

1.2.1 PgP小分子抑制剂

1.2.2 其他逆转策略

1.3 结论和展望

第二章 PgP小分子拮抗剂的筛选和评价

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.2.1 材料

2.2.2 仪器

2.3 方法

2 :3.1主要实验试剂的配制

2.3.2 PgP筛选评价模型的建立

2.3.3 基于转运体外排功能的筛选

2.3.4 耐药逆转的细胞毒实验(CCK-8)

2.3.5 PgP表达的影响(mRNA,蛋白水平)

2.3.6 PgP水解酶活性的影响(Pgp-Glo系统)

2.4.结果与讨论

2.4.1 PgP小分子拮抗剂体外筛选模型的建立和鉴定

2.4.2 基于转运体外排功能的化合物初筛(功能水平)

2.4.3 耐药逆转的细胞毒实验(CCK-8法,细胞水平)

2.4.4 C95对Pgp表达的影响(mRNA,蛋白水平)

2.4.5 C95对PgP水解酶活性的影响(Pgp-Glo系统,分子水平)

2.5 小结

第三章 BCRP小分子拮抗剂的筛选和评价

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.2.1 材料

3.2.2 仪器

3.3 方法

3.3.1 主要实验试剂的配制

3.3.2 BCRP筛选及评价模型的建立

3.3.3 基于BCRP转运体外排功能的筛选

3.3.4 HEK293/BCRP细胞耐药逆转实验(SRB法)

3.4 结果与讨论

3.4.1 BCRP筛选及评价模型的建立

3.4.2 基于BCRP转运体外排功能的化合物初筛(功能水平)

3.4.3 HEK293/BCRP细胞耐药逆转实验(SRB法,细胞水平)

3.5 小结

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

附录

致谢