抗体亲和肽配基的理性设计和色谱表征

摘要

开发快速高效的亲和配基理性设计方法对亲和色谱的应用推广具有十分重要的意义。本论文选择具有重要医药价值的免疫球蛋白G(IgG，抗体)为目标蛋白，开发了高亲和性肽配基的理性设计方法。
　　 首先结合分子对接和IgG亲和色谱建立了高通量筛选方法，获得了较高亲和性五肽EFYDD。实验证明此肽主要以静电作用结合IgG，与蛋白A(SpA)的差异很大，说明高通量筛选方法具有盲目性的缺点。
　　 针对高通量筛选的盲目性，本论文进一步提出了以SpA亲和配基为原型的仿生亲和肽配基理性设计方法。研究先采用全原子分子动力学模拟研究了SpA与IgG之间亲和作用的分子机理。模拟结果表明SpA结合IgG主要受疏水作用驱动，而静电作用主要调节SpA对不同Ig分子的选择性。此外，SpA与IgG的结合主要受热点残基的调控。基于SpA的热点残基和作用力构建了SpA亲和结合模型，为SpA仿生亲和肽配基的设计奠定了基础。
　　 其次，洗脱条件是影响亲和色谱纯化效率的重要因素，在此研究了盐和pH影响SpA与IgG之间相互作用的分子机理。盐主要影响SpA热点残基的疏水作用和静电作用，导致在SpA的螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ之间，以及疏水作用和静电作用之间存在相互补偿，从而使得盐对亲和力影响很小。在pH3.0溶液中，SpA的热点残基H137，R146和K154与IgG相应残基间产生强静电排斥作用从而导致复合物的解离。故SpA的H137，R146和K154是复合物解离的分子基础。这些分子机理进一步完善了SpA的亲和结合模型。
　　 由于全原子分子动力学模拟的计算量太大，无法研究SpA与IgG相互作用过程中的变化。因此采用粗粒化分子动力学模拟研究了SpA-IgG复合物解离的全过程。在pH3.0条件下复合物的解离过程可依次分为构象调整阶段，部分解离阶段，非特异性吸附阶段和完全解离阶段。且SpA的螺旋Ⅱ上热点残基的作用首先被削弱，导致螺旋Ⅱ先于螺旋Ⅰ解离，进一步证明了螺旋Ⅱ是SpA-IgG复合物解离的分子基础。模拟结果表明该方法是一种有效研究蛋白复合物亲和作用的分子动力学方法，可用于配基的理性设计。
　　 最后基于以上分子机理设计并筛选了SpA仿生亲和肽配基。首先根据SpA亲和结合模型理性设计了一个包含28000个多肽的仿生库。然后结合两次分子对接和粗粒化分子动力学筛选得到三个候选七肽。最后，利用亲和色谱实验验证候选多肽的亲和性，获得了与IgG具有高亲和性的七肽YFDWRWE。