精氨酸亲和色谱分离纯化超螺旋质粒DNA

摘要

与病毒载体相比,质粒DNA具有安全性好、毒性和免疫原性较低以及易于生产等诸多优势,在临床上已被广泛用于基因治疗和DNA疫苗。氨基酸亲和色谱是利用小分子氨基酸作为亲和配基,基于氨基酸和超螺旋质粒DNA之间的特异性相互作用进行质粒纯化的色谱方法,具有操作简便、成本低廉等优势。有研究表明,精氨酸亲和色谱对超螺旋质粒DNA具有很好的选择性,且色谱纯化的条件温和、操作简便。本研究以精氨酸作为亲和配基,考察了介质性能(间隔臂长度,配基密度)和操作条件对质粒DNA吸附量和纯化效果的影响。
　　首先,以琼脂糖凝胶SepharoseCL-6B作为基质,利用环氧氯丙烷和1,4-丁二醇-二缩水甘油醚进行活化,得到不同间隔臂长度和活化密度的环氧基团,并进行精氨酸配基的固定化。实验结果表明,不同间隔臂长度的精氨酸亲和介质中配基密度分别为21.8mmol/Lgel(3-carbon)和21.2mmol/Lgel(10-carbon)。同时,以1,4-丁二醇-二缩水甘油醚作为间隔臂活化介质得到配基密度分别为9.6、28.5和47.4mmol/Lgel的精氨酸亲和介质。
　　然后,采用迎头分析的方法,考察不同间隔臂长度和配基密度对质粒DNA动态吸附容量的影响。研究发现,配基和载体之间的间隔臂越长质粒DNA的动态吸附容量越大,质粒DNA的动态吸附容量随配基密度升高而增大,在配基密度为47.4mmol/Lgel时,质粒DNA的吸附容量最大为6.32mg/mLgel。
　　最后,利用精氨酸亲和色谱从E.coli细胞裂解液中直接分离纯化超螺旋质粒DNA,优化了质粒DNA吸附和洗脱的条件,并详细讨论了上样量和配基密度对质粒DNA纯化效果的影响。结果表明,所得质粒样品的纯度和收率随上样量的增加而降低,质粒的收率随配基密度的增加而增大。利用R47-L-Sep色谱从3mLE.coli澄清细胞裂解液纯化制备了约0.35mgscpDNA,约为Sousa等利用精氨酸亲和色谱纯化结果的27倍(12.8μgpDNA/mLgel)。

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第一章 文献综述

1.1前言

1.2质粒DNA的性质、价值及医药标准

1.3质粒DNA初级分离

1.4质粒DNA色谱纯化

1.5色谱介质的展望

1.6本文的研究内容及创新点

第二章 精氨酸亲和介质的制备

2.1前言

2.2实验材料和设备

2.3实验方法

2.4实验结果和讨论

2.5小结

第三章 超螺旋质粒DNA的分离纯化

3.1前言

3.2实验材料和设备

3.3实验方法

3.4结果与讨论

3.5小结

第四章 结论和展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢