酿酒酵母端粒酶全酶亚基Est3p的功能分析

摘要

在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中，至少有5个基因是酵母体内端粒酶活性所必须的，它们是EST1，EST2，EST3，TLC1和CDC13。端粒酶的催化亚基Est2p和RNA亚基Tlc1组成了端粒酶的核心酶。Est1p和Est3p则是端粒酶全酶的另外两个亚基。为了解析端粒酶亚基Est3p在端粒复制中的功能，我们过表达并纯化了重组的野生型及突变的Est3蛋白。其中，野生型Est3蛋白和点突变蛋白Est3-K71A和-T115A能在体外形成二聚体，而点突变蛋白Est3-D49A，K68A和-D166A形成二聚体的能力下降。引起二聚体的能力下降的点突变在体内表现出端粒缩短的表型。在形成二聚体的能力完全丧失的双点突变Est3p-D49A／K68A中，端粒的长度进一步的缩短了。在est3细胞内用centromere质粒异位共表达野生型Est3蛋白和点突变Est3-K71A或-T115A蛋白会导致端粒的缩短，而异位共表达野生型Est3蛋白和点突变Est3-D49A，-K68A，或-D166A蛋白则对端粒长度的调节没有什么影响。这些数据表明二聚化对于体内Est3p的功能是重要的，但二聚化对Est3p的功能并不是必需的。进一步的遗传学研究发现在est3-K68A，-K71A，-F103A，-R110H和-T115A的点突变的细胞中过量表达Est1p不会像在野生型细胞中过量表达Est1p那样引起端粒DNA的增长。而在这些est3点突变的细胞中过量表达Est2p或Tlc1不会像在野生型细胞中过量表达Est2p或Tlc1那样引起端粒DNA的缩短，这表明Est3p的Lys68，Lys71，Phe103，Arg110和Thr115残基对它与Est1p的相互作用是重要的，而与Est2p或Tlc1的相互作用没有什么相关性。对est3-R110的点突变的进一步的研究显示，Est3p的Arg110突变为Lys或His会导致缩短的端粒，而Arg110突变为Ala，Leu，Glu，Asp或Tyr会导致端粒缩短及细胞衰老死亡，表叫Est3p的Arg110在端粒酶功能发挥上起着关键的作用。总结一下，Est3p和Estlp之间存在着功能性的相互作用对于体内端粒酶的活性是必须的，体内端粒酶需要这种相互作用来延伸端粒DNA。

目录

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英文缩写

一.引言

二.材料与方法

三.实验结果

3.1 Est3p蛋白的表达与纯化

3.2Est3p的定性分析

3.3EST3基因的定点突变及对点突变的筛选

3.4Est3p突变体蛋白的表达与纯化

3.5Est3突变体蛋白的定性分析

3.6在酵母细胞中过表达野生型和点突变的Est3p

3.7Est3-D49A/K68A双点突变蛋白的表达，纯化与定性分析

3.8Est3p二聚化在体内的功能研究

3.9Est3p-R110A的点突变会引起端粒的缩短和细胞的衰老死亡

3.10在est△的酵母细胞中过表达Est3p-R110A不能拯救端粒缩短及细胞衰老的表型

3.11过表达点突变的Est3p-R110A，-K68A，-K71A或-T115A导致显性失活的表型

3.12在Est3p-K68A，-K71A，-F103A和-T115A的点突变中，Est1p过表过不能重现在野生型中过表达Est1p延长端粒长度的表型

3.13Est2p的过表达导致端粒长度缩短不受Est3p点突变的影响

3.1.4过表过Tlc1引起端粒缩短的表型没有在Est3p的点突变中受到影响

3.1.5对Est3p-R110K和-R110H点突变的定性分析

3.1.6在Est3p的双点突变K68A/K71A和K68A/T115A中酵母细胞衰老死亡

四.讨论和展望

五.参考文献

六.发表文章目录

七.获奖与参加的国际会议

八.致谢