辅因子对工程酿酒酵母中7-脱氢胆甾醇合成的影响

摘要

7-脱氢胆甾醇是合成维生素D3的重要前体，为了在酿酒酵母中合成7-脱氢胆甾醇，酿酒酵母内源的麦角固醇合成途径必须被敲除，以解除麦角固醇对碳源的竞争。乙酰辅酶A是微生物细胞内起着关键作用的辅因子，也是碳代谢与能量代谢的中心代谢物，氨基酸代谢、脂类代谢和呼吸作用等多个生化反应都需要乙酰辅酶A的参与。以酿酒酵母这一细胞工厂生产7-脱氢胆甾醇时，需要依赖酿酒酵母内源的甲羟戊酸途径合成基本骨架，而乙酰辅酶A又是甲羟戊酸途径的起始底物。因此，如何高效供给乙酰辅酶A成为以酿酒酵母作为宿主细胞生产以乙酰辅酶A为前体的次级代谢物产品的关键。氧化还原平衡状态直接影响次级代谢物的异源合成，这就需要有效的辅因子系统来维持微生物细胞内的氧化还原动态平衡。辅因子为细胞的合成代谢与分解代谢提供了氧化还原的载体和能量传递的媒介，提高了线粒体的功能，调节细胞的生长周期。细胞内氧化还原状态主要取决于自由态NAD_AD+的比值，自由态NAD_AD+比值的波动会引起细胞内代谢的广泛改变。
　　在本研宄中，（1)缺失erg5基因的的酿酒酵母BY4742菌株中的麦角固醇合成被抑制，通过引入人源的C-24还原酶基因成cr2￥，并过表达截断的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因决mg/，构建了一株能够合成7-脱氢胆甾醇的工程酵母，7-脱氢胆甾醇的摇瓶发酵产量为2.62 mg/L。（2)通过过表达内源的乙醇脱氢酶基因adh2和乙醛脱氢酶基因a ld6,引入沙门氏菌源的乙酰辅酶A合成酶基因a c和鼠源的柠檬酸裂解酶基因a c l，有效提高了细胞质内乙酰辅酶A的供给，使7-脱氢胆甾醇的摇瓶发酵产量提高到4.84 mg/L。（3)7-脱氢胆甾醇生产菌株表现出氧化还原不平衡，正是由于其自由态NAD_AD+的比值均高于野生型对照组。在7-脱氢胆甾醇生产菌株中表达肺炎双链球菌源的NADH氧化酶NOX和荚膜组织胞浆菌源的选择性氧化酶AOX1组成的辅因子再生体系，能有效降低自由态NADH/NAD+的比值，缓解7-脱氢胆甾醇生产菌株中氧化还原不平衡的状态，使7-脱氢胆甾醇的摇瓶发酵产量提高到8.44 mg/L，发酵罐优化后的产量达到44.49 mg/L，为目前已知的最高产量。
　　本研究为7-脱氢胆甾醇的生物合成及产量的提高提供了思路与参考，具有一定的指导意义。

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第一章文献综述

1.1 7-脱氢胆甾醇的简介与研究现

1 .2乙酿辅酶A 与次级代谢产物的生物合成

1 .3氧化还原平衡与次级代谢产物的生物合成

1 .4本课题的主要内容

第二章材料与方法

2 .1实验菌株

2 .2实验仪器

2 .3实验试剂

2 .4培养基的配置

2 .5基因元件的获得

2 .6酵母转化方法

2 .7发酵培养方法

2 .8产物提取方法

2.9 GC-TOF-MS检测方法

2 .1 0乙酰辅酶A定量方法

2.1 1海藻糖定量方法

2 .1 2细胞总NADH/NAD+的测定

2 .1 3胞内小分子代谢物的提取方法

2.14胞内小分子代谢物的LC-MS检测方法

第三章7-脱氢胆甾醇生产菌株的构建

3.1 7-脱氢胆甾醇合成模块的构建

3.2 7-脱氢胆甾醇生产菌株的构建

3 .3小结

第四章乙酰辅酶A对7-脱氢胆甾醇合成的影响

4 .1乙酰辅酶A 合成増强模块的构建

4 .2乙酰辅酶A 合成增强模块对7-脱氢胆甾醇合成的影响

4 .3乙酰辅酶A合成增强模块对麦角固醇合成的影响

4 .4小结

第五章氧化还原平衡对7-脱氢胆甾醇合成的影响

5 .1溢流代谢的发现

5 .2氧化还原不平衡原因的探究

5 .3辅因子再生模块的构建

5 .4辅因子再生模块对7-脱氢胆甾醇合成的影响

5.5 7-脱氢胆甾醇的发酵优化

5 .6小结

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢