亲和双水相胶团萃取与荷电磁性粒子辅助蛋白质复性研究

摘要

蛋白质的分离纯化与体外复性是基因重组蛋白生产过程中的两个关键步骤。随着基因工程和发酵技术的快速发展，重组蛋白质的种类和表达量不断提高，急需研发高效的分离纯化和复性技术。本文研发了一种新型亲和双水相胶团系统用于蛋白质分离，以及两种荷电磁性纳米粒子用于辅助同电荷蛋白质复性。
　　双水相胶团萃取是一种简单、快速的生物分离技术，但是选择性较低。本文开发了一种新型亲和双水相胶团系统，以提高其分离选择性，系统研究了该系统的性质及其蛋白质分离纯化性能。首先，通过在非离子表面活性剂Triton X-114(TX-114)上偶联亚氨基二乙酸（iminodiacetic acid, IDA）基团合成了可螯合镍离子的表面活性剂TX-Ni，研究了TX-Ni与TX-114混合溶液的性质。结果表明，二者在溶液中形成了混合胶束，但是由于空间位阻较大和静电排斥作用，TX-Ni的加入不利于胶团的形成，并且抑制了胶团间的聚集。加之IDA基团极性大、水化能力强，使系统的浊点温度随TX-Ni含量的增大而升高；无机盐对浊点的影响则符合Hofmeister离子序列，可以通过加入亲液离子降低浊点，使萃取在较低的温度下进行。将亲和双水相胶团系统应用于蛋白质的分离纯化，研究了带有六组氨酸标签的重组绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）和溶菌酶在亲和双水相胶团系统中的分配行为。研究发现，亲和双水相胶团系统对富含组氨酸的蛋白质具有高选择性，在TX-Ni的摩尔分率由0增大至0.1时EGFP的分配系数从0.6增大到12.4，提高了20倍。pH和盐浓度对分配系数的影响显著，说明亲和作用在萃取过程中占主导地位。最后，将该亲和双水相胶团系统用于细菌裂解液中萃取EGFP，终产物纯度可达70％，收率大于80%。
　　近年的研究表明，表面修饰有聚电解质的聚合物微球能够有效抑制同电荷蛋白质的聚集，从而辅助蛋白质复性。由于微球粒径越小、电荷密度越高，辅助复性的效果越好，本文致力于研发高电荷修饰密度的磁性纳米粒子。以N,N,N-三甲基-3-(2-甲基烯丙酰氨基)-1-氯化丙铵（[3-(methacryloylamino)propyl]-trimethylammonium chloride, MAPTAC）和甲基丙烯酸（methacrylic acid, MAA）为单体，通过原子转移自由基聚合反应，在Fe3O4纳米颗粒表面修饰聚电解质。研究表明，制备的阳离子磁性纳米粒子Fe3O4@PMAPTAC和阴离子磁性纳米粒子Fe3O4@PMAA可以具有较高的电荷密度，对蛋白质的静态吸附容量较高。因为颗粒表面的非特异性吸附较强，聚合物链较长时才能获得好的辅助复性效果。同时，荷电磁性纳米粒子可以用外加磁场进行快速分离与回收利用。

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第一章 文献综述

1.1前言

1.2双水相胶团萃取技术

1.3亲和分离技术

1.4蛋白质体外复性

1.5原子转移自由基聚合

1.6本文研究内容及目的

第二章 亲和双水相胶团系统的制备与性质

2.1引言

2.2材料和方法

2.3结果与讨论

2.4小结

第三章 亲和双水相胶团萃取蛋白质的研究

3.1引言

3.2材料和方法

3.3结果与讨论

3.4小结

第四章 同电荷磁性纳米粒子辅助蛋白质复性

4.1引言

4.2材料和方法

4.3结果与讨论

4.4小结

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2主要创新点

5.3展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

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