模式植物CLE多肽基因家族的生物信息学分析与鉴定

摘要

CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)多肽激素是近十年来研究最热的植物多肽激素，也是迄今为止最大的植物多肽分子家族，主要通过编码一小段分泌蛋白来参与细胞间的信号转导，进而在植物生长发育过程中维持干细胞增殖与分化间的平衡，特别是在茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM)、根尖分生组织(root apical meristem,RAM)以及原形成层(procambium)等组织的发育调控中起着关键的作用。尽管CLE基因家族在拟南芥和水稻等模式植物中已有一定的研究，但在木本模式植物杨树与肉果类模式植物番茄中，有关CLE多肽基因家族的研究尚属空白。
　　本文以模式植物杨树和番茄作为研究对象，利用拟南芥全部32个CLE基因的序列在Phytozome等数据库中进行基因的检索与挖掘，共获得50个杨树CLE候选基因(PtCLE)和15个番茄CLE候选基因(SlCLE)。随后利用生物信息学手段，分别对杨树和番茄的CLE基因进行了基因理化性质分析、信号肽预测、基因结构分析、染色体定位、多序列比对、蛋白全长和CLE12肽进化树的构建、上游调控区顺式作用元件的查找以及表达热图谱的绘制等。在杨树中，本文还挑选出了3个与AtCLV3同源，6个与AtCLE41/44同源的杨树CLE基因，对这9个PtCLE基因进行了克隆与表达载体的构建等，并通过实时定量PCR技术对其组织特异性的表达进行了验证。在番茄中，本文对全部15个番茄CLE基因进行了实时定量组织特异性表达验证，并挑选出了3个特异性表达的基因SlCLE10、12和13。对上述3个SlCLE基因的CLE12肽进行人工合成后，通过体外添加多肽的方法来处理番茄，发现这3种12肽均能抑制番茄主根的伸长，其中SlCLE12对根的抑制作用最为明显，而且在下胚轴伴有花青素的大量积累。
　　本文利用生物信息学、比较基因组学等方法，首次对杨树和番茄这两种模式植物的CLE基因家族进行了鉴定与分析，是对植物信号转导过程研究的重要补充。同时，本文也为对木本模式植物维管组织形成与发育的研究，以及对肉果类模式植物果实发育与成熟的研究等提供了重要的理论依据。

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第一章 文献综述

1.1模式植物概述

1.1.1 模式植物

1.1.2 拟南芥

1.1.3 杨树

1.1.4 番茄

1.2 CLE多肽激素的结构与分类

1.2.1 CLE多肽激素的结构

1.2.2 CLE多肽激素的分类

1.3 CLE多肽基因家族的研究进展

1.3.1 CLE多肽激素对茎端分生组织发育的调控

1.3.2 CLE多肽激素对维管分生组织发育的调控

1.3.3 CLE多肽激素对木本模式植物维管分生组织发育的调控

1.3.4 CLE多肽激素对根尖分生组织发育的调控

1.4 本文研究的目的与意义

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究意义

第二章 杨树与番茄CLE多肽基因家族的生物信息学分析

2.1 生物信息学分析方法

2.1.1 CLE基因的查找

2.1.2 CLE基因信息的检索

2.1.3 CLE基因染色体定位

2.1.4 CLE基因的多序列比对

2.1.5 CLE基因进化树的构建

2.1.6 CLE基因上游调控区顺式作用元件的查找

2.1.7 CLE基因表达热图谱的构建

2.2 结果与分析

2.2.1 CLE基因的检索分析

2.2.2 CLE基因的结构分析

2.2.3 CLE基因的进化分析

2.2.4 CLE基因上游调控区的顺式作用元件分析

2.2.5 CLE基因的表达分析

第三章 杨树与番茄CLE基因的克隆与组织特异性表达分析

3.1 材料与试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂与仪器

3.2 实验方法

3.2.1 总RNA的提取以及cDNA的合成

3.2.2 目的基因的PCR扩增

3.2.3 克隆载体的构建

3.2.4 表达载体的构建

3.2.5 农杆菌的转化

3.2.6 杨树与番茄CLE基因的表达分析

3.3 结果与分析

3.3.1 总RNA提取与cDNA合成分析

3.3.2 杨树CLE基因的PCR克隆分析

3.3.3 杨树pJET1.2-PtCLE的连接、筛选与测序分析

3.3.4 杨树pBI121-PtCLE的连接、筛选与测序分析

3.3.5 杨树CLE基因的农杆菌转化与验证

3.3.6 杨树CLE基因的表达分析

3.3.7 番茄CLE基因的表达分析

第四章 番茄CLE多肽激素的功能验证

4.1 材料与试剂

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器与试剂

4.2 实验方法

4.2.1 种子的消毒

4.2.2 CLE多肽培养基的配制

4.2.3 点种子

4.3 番茄CLE多肽功能验证结果与分析

第五章 全文结论与展望

5.1 全文结论

5.1.1 杨树CLE基因家族的研究结论

5.1.2 番茄CLE基因家族的研究结论

5.2 全文展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢