假单胞菌和酿酒酵母利用木糖共培养生产PHA的初步研究

摘要

聚羟基烷酸酯（PHA）是一种环境友好型高分子生物塑料，由于其具有良好的生物可降解性和生物相容性，PHA被广泛的应用于医药包装、塑料制造以及高分子材料等领域。本文利用从天津市纪庄子污水处理厂中筛选出一株PHA生产菌：假单胞菌TU02，然后对其进行了可利用的碳源测试，最终选择葡萄糖作为底物进行PHA发酵生产。同时，利用基因工程菌酵母菌和假单胞菌在木糖培养基中共培养，以实现木糖到PHA转化。经过一系列实验，本文主要得到的研究结果如下：
　　考察了假单胞菌TU02对常用碳源的利用情况，发现其能够在葡萄糖、蔗糖、乳酸钠、酵母提取物作为单底物时良好生长，在木糖以及乙酸钠中几乎没有生长现象，在柠檬酸中则是完全没有生长。其中，假单胞菌TU02在葡萄糖培养基中生长最好。
　　利用葡萄糖作为底物，让假单胞菌TU02在摇瓶中发酵生产PHA，并对培养条件进行了初步优化。经过不同培养条件的对比，发现当培养基中，缺乏磷源时，假单胞菌几乎不能生长，而供给磷源而缺乏铵盐和镁离子时，假单胞菌生长也受到了严重的抑制。培养过程中，假单胞菌TU02在48h后有明显的衰亡现象，其接种48h后的菌液的OD600低于48h，菌体量有减少的现象，同时其PHA积累量也有所减少，最终得到的最佳发酵条件为：葡萄糖浓度20g/L，pH=8，培养时间48h左右，PHA达到细胞干重的38％。尽管在此条件下假单胞菌的PHA百分比含量为所有条件中的最高值，但在pH值为7时，假单胞菌TU02的菌体量最大，达到4.7g/L，假单胞菌TU02的PHA产量在所有条件下达到最大值1.62g/L。
　　将能利用木糖的重组酿酒酵母和能积累PHA的假单胞菌TU02在木糖培养基中混合培养，两者能够很好的共生并且积累一定量的PHA。在酵母菌和假单胞菌接种比为1:2，假单胞菌12h后接种的条件下，最终PHA积累达到了细胞干重的14%，最大产量达到0.37g/L。
　　尽管混菌最大PHA产量0.37g/L远低于单菌的1.62g/L，但本研究最终实现了木糖到PHA的转化，也为后续的混菌PHA产量提升打下了基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1聚羟基烷酸酯（PHA）概述

1.1.1 PHA简介

1.1.2 PHA理化性质以及应用

1.1.3 PHA合成

1.1.4 PHA检测以及提取方法

1.1.5木质纤维素及其水解物在PHA生产上的应用

1.2假单胞菌概述

1.2.1假单胞菌简介

1.2.2假单胞菌在PHA生产上的应用

1.3酵母菌概述

1.3.1酵母简介

1.3.2酵母菌在基因工程的应用

1.3.3酵母的木糖利用途径

1.4混菌共培养以及混菌产PHA概述

1.5课题意义以及本文研究内容

1.5.1课题意义

1.5.2本文研究内容

第二章 假单胞菌的PHA生产以及优化

2.1材料与方法

2.1.1实验菌种

2.1.2实验药品与试剂

2.1.3实验仪器

2.1.4培养基配方以及配制方法

2.2实验方法

2.2.1菌株筛选与培养

2.2.2细菌基因组提取

2.2.3细菌基因组PCR扩增

2.2.4琼脂糖凝胶电泳

2.2.5 DNA胶收

2.2.6胶收产物纯化

2.2.7菌液细胞浓度测定

2.2.8 PHA含量测定

2.3结果与讨论

2.3.1菌株基因组扩增结果

2.3.2假单胞菌碳源利用测试

2.3.3假单胞菌发酵生产PHA以及发酵条件优化

2.4本章小结

第三章 混菌共培养以及PHA生产

3.1材料与方法

3.1.1实验药品与试剂

3.1.2实验仪器

3.1.3实验菌株与菌株培养

3.1.4培养基与试剂配方

3.1.5酿酒酵母菌生长曲线测定

3.1.6假单胞菌与酿酒酵母混菌共培养

3.2结果与讨论

3.2.1酵母生长曲线测定

3.2.2双菌共培养结果

3.2.3混菌生物量测定

3.2.4混菌共培养产PHA实验

3.3本章小节

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢