甘草不定根的反应器培养及诱导子的作用研究

摘要

甘草(Glycyrrhiza uralensis)系豆科多年生草本植物，主要以根和根茎入药，在中药中应用最广泛，素有“十方九草”之称。同时，甘草也是一种重要的药食两用资源，其主要成分甘草酸在食品工业中还被广泛用作甜味剂，其甜度约为蔗糖的250倍。除此之外，甘草提取物还被广泛地应用于化工等领域。因此，国内外市场对其的需求量很大。本文在已建立的甘草不定根培养体系下，进行了鼓泡式生物反应器培养的研究，另外，针对甘草组织培养物中活性成分含量偏低等问题，进行了诱导子的作用研究。
　　本文针对甘草不定根的反应器培养进行了条件优化，考察了三种不同角度（60°圆锥型，90°圆锥型，180°球型）的鼓泡式反应器、梯度通气量、碳源和盐强度对甘草不定根的影响，得到最佳反应器为90°圆锥型鼓泡式生物反应器，最佳培养条件分别为0.4-0.6-0.4vvm通气量、4％的蔗糖、1 MS培养基的盐强度。
　　为了进一步提高甘草不定根中甘草酸等活性成分的含量，进行了诱导子的作用研究。考察了水杨酸、黑曲霉、不饱和脂肪酸（α-亚麻酸和亚油酸）、毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母等多种诱导子对甘草不定根生长和代谢产物积累的影响。研究发现季也蒙毕赤酵母可以显著提高不定根中代谢产物的含量，尤其是浓度为200 mg·L-1时效果最为显著，总黄酮的含量(9.89mg·g-1)、甘草酸的含量(0.92 mg·g-1)、甘草次酸的含量(0.64 mg·g-1)以及多糖的含量(89.95 mg·g-1)分别是对照组的3.76、5.41、4.57和2.58倍。
　　为了研究诱导子的作用机制，本文考察了诱导子对甘草不定根中化合物类型、信号分子的积累、抗氧化酶活性、抗性基因表达量以及甘草酸代谢过程中关键基因的表达量的影响，发现诱导子可以增加与抗性反应相关的信号分子如细胞表面磷脂酶PLA2活性以及Ca2+、SA、JA、NO和ET等信号分子的积累以及抗氧化物酶SOD、POD、CAT的活性，也可以提高抗性基因PDF1.2、NOS、PR1、PAL、LOX、ABA8表达量以及甘草酸代谢过程中关键基因HMGR、GPS、FPS、SQS、 SE、β-AS、CYP88D6和CYP72A154的表达量，并且会导致不定根中化合物种类的改变。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1.药用植物组织培养研究进展

1.1.1药用植物不定根培养研究进展

1.1.2 药用植物不定根反应器培养

1.2甘草活性成分以及次级代谢调控研究

1.2.1甘草的主要活性成分和其药理活性

1.2.2甘草次生代谢途径的研究进展

1.3甘草组织培养研究进展

1.3.1 甘草愈伤组织培养研究

1.3.2 甘草细胞悬浮培养研究

1.3.3 甘草快繁苗培养研究

1.3.4 甘草毛状根培养研究

1.3.5 甘草不定根培养研究

1.3.6 反应器培养在甘草组织培养中的应用

1.4诱导子在组织培养中的应用

1.4.1诱导子的诱导作用

1.4.2诱导子的作用机制

1.4.3诱导子在提高三萜类成分和黄酮类成分中的应用

1.4.4诱导子在甘草组织培养中的应用

1.5立题依据

第二章 甘草不定根的反应器培养条件优化

2.1材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 实验仪器

2.2试验方法

2.2.1甘草不定根培养条件的优化

2.2.2 DPPH法测定甘草中黄酮和多糖的抗氧化活性

2.3分析方法

2.3.1干重增值倍数的测定

2.3.2 培养基中电导率 (EC)的测定

2.3.3 甘草中黄酮、甘草酸和甘草次酸含量的测定

2.3.4甘草中多糖成分的测定

2.3.5 DPPH法测定甘草中黄酮与多糖抗氧化活性

2.4 结果与讨论

2.4.1甘草不定根培养条件的优化

2.4.2甘草中黄酮和多糖对DPPH自由基的清除作用

2.5 小结

第三章 诱导子对甘草不定根的作用研究

3.1实验材料

3.1.1 实验材料

3.1.2主要试剂

3.1.3实验仪器

3.2试验方法

3.2.1不同浓度水杨酸（SA）对甘草不定根生物量和代谢产物积累的影响

3.2.2不同浓度黑曲霉（Aspergillus niger）作用评价

3.2.3不同浓度不饱和脂肪酸（α-亚麻酸和亚油酸）对甘草不定根生物量和代谢物积累的影响

3.2.4不同浓度毕赤酵母菌（Pichia pastoris）作用评价

3.2.5不同浓度季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）作用评价

3.3 分析方法

3.3.5 抗氧化物酶活性

3.3.6信号分子的检测

3.3.7 RNA提取、cDNA 合成、以及PCR分析

3.3.8 蛋白电泳分析

3.4 结果与讨论

3.4.1水杨酸（SA）的作用评价

3.4.2黑曲霉（A. niger）作用评价

3.4.3α-亚麻酸和亚油酸对甘草不定根生长和代谢产物的影响

3.4.4不同浓度毕赤酵母菌（Pichia pastoris）作用评价

3.4.5不同浓度季也蒙毕赤酵母（M. guilliermondii）作用评价

3.5 小结

第四章 结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢