维生素C一步混菌发酵体系的设计与构建

摘要

随着合成生物学的快速发展，通过设计与构建人工多细胞体系以实现一系列复杂功能已成为学者们的研究热点之一。在混菌体系中，微生物菌群在完成各自功能的基础上，通过物质、能量和信息的交换以实现菌群间的相互作用，在工业生产环境中，菌群间的相互作用关系则呈现出更为多样化的特点。本文以维生素C工业生产体系为研究对象，设计构建不同的人工混菌体系以实现由 D-山梨醇到维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的一步转化，并通过对菌株的理性设计与改造进一步改善体系中菌株间的相互作用关系，为人工混菌体系的构建提供新的思路。 针对维生素C传统两步发酵工艺生产周期长、二次灭菌等问题，依据共生原理，本文成功设计构建Gluconobacter oxydans-Ketogulonicigenium vulgare两菌一步发酵体系，同时综合实验室条件和生产成本等多种因素后优化发酵条件。通过对菌株的理性设计与改造，重构混菌体系中菌群的相互作用关系，实现对人工混菌体系的适配性调控。利用改造菌株与产酸菌配合混菌发酵，2-KGA于36 h内的最大摩尔转化率达89.7%，相比于原始两菌一步发酵体系提高了29.6%。 在两菌一步发酵体系的基础上，针对工业生产中产酸菌K. vulgare单独培养困难等问题，本文设计构建G. oxydans-K. vulgare-Bacillus megaterium三菌一步发酵体系以进一步优化维生素 C一步发酵工艺。通过在工业一步菌中构建并优化一系列基于群体感应系统的死亡基因模块组合：tufB-luxI-Ter-tufB-luxR-Ter-(N×) lux pR-RBS-ccdB-Ter（其中N=1,2,3,5），以实现工业一步菌的程序性死亡。利用优化的混菌体系配合发酵，36 h内2-KGA的最大摩尔转化效率达80.7%，相比于原始三菌一步发酵体系提高了21.4%。 本文随后分别以两菌一步发酵体系和三菌一步发酵体系为研究对象，从代谢水平进行分析以更好地解析不同混菌体系中微生物菌群间的相互作用关系。研究发现，单一代谢路径的改变对两菌一步发酵体系中胞内氨基酸、核苷酸、不饱和脂肪酸和TCA循环等相关小分子代谢物均产生了一定程度的影响。二者由最初的偏利共生和竞争关系转变为互利共生关系。此外，一步菌中群体感应系统的构建对三菌一步发酵体系中胞内氨基酸、TCA循环和饱和脂肪酸等小分子代谢物产生了一定的影响。在两菌一步发酵体系的基础上，新引入的大菌与改造的一步菌协同作用更好地配合产酸菌生长产酸。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 微生物混菌体系的研究

1.2 群体感应系统的概述及研究进展

1.3 人工混菌体系的应用

1.4本文的研究意义及主要内容

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 分析检测

第3章 两菌一步发酵体系的设计与构建

3.1 维生素C两菌一步发酵体系的设计

3.2 维生素C两菌一步发酵体系的构建

3.3 小结

第4章 两菌一步发酵体系相互作用关系的解析

4.1 两菌一步发酵体系胞内代谢物分析

4.2 两菌一步发酵体系氨基酸代谢的变化

4.3 两菌一步发酵体系核苷酸类物质代谢的变化

4.4 两菌一步发酵体系脂肪酸代谢的变化

4.5 两菌一步发酵体系TCA循环相关代谢物的变化

4.6 小结

第5章 维生素C三菌一步发酵体系的设计与构建

5.1维生素C三菌一步发酵体系的设计

5.2 维生素C三菌一步发酵体系的构建

5.3 小结

第6章 三菌一步发酵体系相互作用关系的解析

6.1 三菌一步发酵体系胞内代谢物的主成分分析

6.2 三菌一步发酵体系胞内代谢物随发酵过程的变化

6.3 三菌一步发酵体系胞内代谢物对群体感应的响应

6.4 小结

第7章 结论与展望

7.1 结论

7.2 创新点

7.3 展望

参考文献

附录A

发表论文和参加科研情况说明

致谢