枯草芽孢杆菌LipA的表达和分泌研究

摘要

Bacillus subtilis的脂肪酶（LipA）是分子量最小的脂肪酶之一，没有界面活性，最适pH10.0，在多个领域具有潜在的应用价值。本文以提高LipA发酵产量为目的，研究了表达元件，基因拷贝数对LipA表达的影响；也研究了胞外蛋白缺失和Sec途径构成蛋白的过表达对LipA分泌的影响。 用PAE和Pcdd表达盒分别整合过表达lip基因，得到菌株B. subtilis BNAAL和BNACL。摇瓶发酵显示，BNAAL的胞外LipA活性为12.6 U/mL，是BNACL的 1.7 倍。以质粒 pHP13 为载体，构建 Pcdd-lip 基因表达质粒 pHPCL；以质粒pUB110 为载体，构建高拷贝 PAE-lip 基因表达质粒 pUBAL。摇瓶发酵显示， BNA/pHPCL和BNA/pUBAL菌株的胞外LipA活性大幅度低于BNA/pHP13L，出现了强表达元件和增加基因剂量反而降低胞外LipA活性的反常现象。荧光定量PCR方法对lip基因的转录分析显示，Pcdd-lip转录水平低于PAE-lip，高拷贝的PAE-lip基因转录水平低于低拷贝数的PAE-lip基因。导致反常的原因未知。 在B. subtilis BNA中，分别组成型过表达Sec途径的组分SecA-prfB、SecDF、SecYEG和PrsA蛋白，分别构建了重组菌株BNAS1/pHP13L、BNAS2/pHP13L、BNAS3/pHP13L和BNAP/pHP13L。摇瓶发酵显示，过表达SecDF、SecYEG和PrsA蛋白分别使胞外LipA活性提高了27.8%、8.6%和49.5%；其中过表达PrsA蛋白的效果最显著，相应菌株的胞外LipA活性达到269.8 U/mL。结果表明，Sec途径的某些构成蛋白的胞内水平，是影响LipA分泌的限制性因素。 在B. subtilis BNAY5基础上，进一步缺失胞外蛋白Pel、Epr和WapA，构建了缺失8个主要胞外蛋白的重组菌株BNAY8。BNAY8/pHP13L的胞外LipA活性为190.2 U/mL，相对于BNA/pHP13L的180.5 U/mL没有显著提高。说明在实验条件下，这些分泌蛋白与LipA之间，不存在对Sec途径的明显竞争关系。 在B. subtilis BNA和BNAY8中同时过表达secDF和prsA基因，构建重组菌BNAS2P/pHP13L和BNAY8S2P/pHP13L。摇瓶发酵显示，二者的胞外LipA活性分别为287.8 U/mL和291.1 U/mL。结果说明，缺失8个主要分泌蛋白对于LipA的分泌没有明显影响，但是secDF和prsA基因共同过表达，对于提高LipA的分泌效率具有明显的协同作用。Sec 途径某些成分的胞内水平，是影响 LipA 分泌的限制性因素。

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第1章 文献综述

1.1 枯草芽孢杆菌脂肪酶

1.1.1 枯草芽孢杆菌脂肪酶基因

1.1.2 枯草芽孢杆菌脂肪酶

1.1.3 微生物脂肪酶的应用

1.1.4 枯草芽孢杆菌脂肪酶发酵菌株的遗传育种

1.2 Sec运输途径的组成和运输原理

1.2.1 Sec运输途径的信号肽与信号肽酶

1.2.2 Sec运输途径的伴侣分子及通道蛋白

1.2.2 Sec运输途径的运输原理

1.3 Sec运输途径的修饰与蛋白分泌

1.4 B. subtilis的主要分泌蛋白

1.5 B. subtilis的主要胞外蛋白水解酶

1.6 本文的研究内容与目的

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 PCR引物

2.1.3 主要药品

2.1.4 主要试剂

2.1.5 培养基

2.1.6 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 B. subtilis染色体的提取

2.2.2质粒的提取-CTAB法

2.2.3 PCR扩增

2.2.4 一步重叠延伸PCR[61]

2.2.5 两步重叠延伸PCR

2.2.6 琼脂糖凝胶电泳

2.2.7 B. subtilis感受态细胞转化[62, 63]

2.2.8 无标记基因敲除法[64]

2.2.9 酶切和酶连反应

2.2.10 菌种的保藏