FRET联合AIE原位检测还原敏感胶束药物释放的研究

摘要

该课题计划将模型药与氧化还原敏感的聚合物胶束通过二硫键相连接，而AIE探针和FRET技术的结合使用可以实现对该聚合物胶束药物释放的原位检测。本课题以聚乙二醇-聚赖氨酸（mPEG-PLys）为骨架，具有荧光效应的姜黄素（Cur）作为模型药物，经典的AIE探针-四苯基乙烯（TPE）作为FRET供体，姜黄素（Cur）作为FRET受体，以此构成聚合物。本文的研究目的是将FRET技术和AIE探针联合使用在同一氧化还原敏感的纳米胶束载体中，对胶束中姜黄素释放动力学进行原位研究监测。 目标共轭聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE的合成主要涉及到三个片段（聚合物骨架、TPE衍生物、Cur衍生物）的连接。TPE衍生物（TPE-OH和TPE-COOH）的化学结构通过氢谱、碳谱以及质谱得到了证实。聚合物的合成利用mPEG-NH2作为大分子引发剂，诱导N-羧基-环内酸酐（NCA）单体，即N6-苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐（Lys(Z)-NCA）发生开环反应。随后，聚合物mPEG-PLys(Z)的末端氨基与TPE-COOH的羧基发生缩合反应，形成TPE修饰的聚合物，即mPEG-PLys(Z)-TPE。mPEG-PLys(Z)-TPE脱去苄基保护基后在侧链形成游离氨基，能够与姜黄素（Cur）进行连接。姜黄素衍生物Cur-SS-COOH的结构通过核磁共振和质谱分析手段得到了证实。最终的目标聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE的结构通过核磁共振得到了确认，共轭分子量最终确定为8,479Da。 与对照聚合物mPEG-PLys(Z)相比，聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂时，在500nm以下波长内展现出很强的光谱吸收，这是由于Cur和TPE与mPEG-PLys(Z)发生共轭的结果。当用水取代DMF时，mPEG-PLys(Cur)-TPE聚合物会自组装成胶束，自组装后，体系中的Cur与TPE会包裹进胶束疏水空腔内部，吸收强度减小。水相胶束体系自由（非组装）聚合物与聚集（组装）聚合物之间存在着动态平衡，因此水相胶束的最大吸收波长与有机溶液中的最大吸收波长相比会降低。为了检测聚合物胶束的AIE性能，我们将DMF按照不同的比例添加到mPEG-PLys(Z)-TPE胶束的悬浮液中。结果表明，聚合物胶束在混合溶液中表现出了不同的稳定性：DMF的比例越高，聚合物胶束的稳定性越低。随着DMF比例的增加，AIE效应逐渐减弱，这是因为聚合物胶束发生解体进而TPE分子分散。作为对照物，TPE衍生物（TPE-COOH）也同样显示出了优异的AIE效应。此外，我们对mPEG-PLys(Cur)-TPE在水/DMF混合溶剂中的发射光谱进行了检测，实验结果表明AIE效应随着FRET效应的减弱而逐渐消失，ACQ效应也随着药物（Cur）的释放而消失。 为了检测mPEG-PLys(Cur)-TPE胶束的FRET效应，我们首先测定了TPE的发射光谱和Cur的吸收光谱，对比发现两图有很大的重叠部分，证实了TPE和Cur可以作为优良的FRET对。然而，这两种光谱并没有完全叠加，因此TPE作为FRET供体在最大吸收波长（349nm）处激发时，mPEG-PLys(Cur)-TPE胶束的激发光谱包含两个部分。其中一部分是由TPE的局部发射而激发Cur的发射，另一部分是不能够激发Cur的TPE残留部分的发射。这就导致了两种发射光谱在349nm和462nm（即Cur的最大激发波长）之间的形状差异。由于mPEG-PLys(Cur)-TPE胶束在462nm波长条件下只能激发Cur发射，所以在462nm波长条件下激发产生的发射光谱强度较小。 本研究中引入的FRET机制是通过相互验证的方法产生两个相关的荧光信号，从而使Cur的释放动力学“可视化”。由于ACQ效应的减弱，Cur的荧光强度随着从胶束载体中的释放而增大。TPE的存在（作为FRET供体）为药物释放性能的检测提供了额外的信息。当胶束完好无损时（没有Cur释放），从TPE到Cur的能量转移导致TPE的荧光效应减弱。随着Cur的稳定释放，FRET现象变得不再明显，而TPE又逐渐恢复了荧光效应。 在生理条件下，二硫键具有一定的稳定性，但在细胞质中GSH作用下会发生断裂。因此，本研究中使用浓度为10mM的GSH来模拟细胞内的还原环境。理论上，二硫键断裂后模型药物Cur被释放，ACQ现象减弱。此外，FRET效应失去受体，来自供体（TPE）的发射会更加“可视化”，而实验数据也很好地支持上述推测。TPE和Cur的荧光强度随时间的推移而增加。值得注意的是，由于药物的水溶性较差（<1μg/mL），因此为了溶解从胶束中释放的Cur，该体系中加入5%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）。GSH引发氧化还原敏感聚合物胶束药物释放持续了几个小时，这主要是因为二硫键和硫醇交换过程极为缓慢。亲水性的GSH（logP=-4.5）进入疏水性的胶束内核会带来额外的扩散屏障。胶束的吸收强度随时间推移而增强，这是药物释放的结果。随着Cur的释放，胶束的粒径也慢慢增大。这是因为Cur的释放改变了两亲性聚合物的亲水/疏水链段比例，降低了胶束自组装的驱动力。 由于GSH诱发药物从纳米载体的释放是一个相当缓慢的过程，本研究还使用了另一种还原分子（TCEP），这种分子能够在几分钟之内使二硫键迅速断裂。类似地，在加入TCEP后，TPE和Cur发射光谱的强度随着时间的推移而增加，这是由于FRET效应受到了破坏或削弱，而且光谱出现显著变化的时间也由几小时缩短到几分钟。这主要是因为引入的TCEP采用了不同的机制来切断二硫键，从而克服了二硫键和硫醇交换的动力学障碍。胶束的吸收谱随着时间的推移强度不断增大，动力学粒度分析显示胶束粒径不断膨胀，这也与FRET荧光结果分析保持一致。该现象是由于药物释放引起，疏水性药物的释放导致聚合物的疏水性减弱，颗粒膨胀或聚集。已有报道显示聚合物两亲性比例的变化能够引起胶束粒径的改变。通过测定胶束在10mM的GSH（2h和24h）或10mM的TCEP（2h）作用下的胶束CMC，分别对断裂二硫键，诱导Cur释放的效率进行了评估。根据实验结果可以明显看出，在相同浓度条件下（10mM）用TCEP处理2h与用GSH的处理24h产生CMC结果相同，这说明TCEP还原能力远远强于GSH，对于二硫键的断裂具有更高的效率。 此外，我们还对细胞水平的药物释放进行了评估。利用人类乳腺癌细胞（MCF-7）对该氧化还原敏感胶束的治疗效果进行考察。由于GSH是细胞质内源性物质，因此不需要补加额外的GSH。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析结果表明，TPE和Cur的荧光强度随着时间的推移而增加，这是由于GSH引发的Cur释放而导致Cur和TPE之间的FRET效应随之下降的结果。利用高效液相色谱（HPLC）测定了不同时间点细胞累积释放量的百分率，与荧光强度分析结果一致。此外，流式细胞仪分析也显示了同样的趋势。这一趋势也完全符合在磷酸盐缓冲盐水（PBS）的体外释放研究结果。PBS和细胞质的药物释放时间间隔与二硫键和硫醇交换反应缓慢相吻合。相比之下，当MCF-7细胞以相同剂量的单一TPE或Cur处理时，TPE或Cur的荧光强度在相同时间内没有明显改变，这是因为这两种条件下都没有出现FRET现象。用GSH或丁硫氨酸亚砜胺（BSO）预处理的细胞分别作为阳性和阴性的对照。增加细胞内GSH可以加速药物释放，相应地TPE与Cur的荧光强度迅速增强。相反的，用BSO的预处理会降低细胞内GSH的含量，从而使影响荧光效应的释放动力学变化缓慢。虽然TCEP比GSH具有更高效二硫键的断裂能力，但它一般不能通过细胞膜，因此本文没有开展细胞内TCEP介导Cur释放的相关研究。有趣的是，在细胞内的药物释放过程中，TPE荧光强度的增加与时间增加成较好的线性关系，这一结果与Cur荧光强度变化形成了鲜明的对比，Cur荧光强度增加与时间的增加并没有呈现出很好的线性关系。这一现象主要归因于TPE的高分辨率和抗光漂白性。TPE基团的存在不仅利于荧光药物原位释放的监测，而且为非荧光剂的释放提供了信息。单一的TPE在高达21μg/mL浓度下也没有表现出明显的细胞毒性，共价连接Cur的胶束和单一Cur的IC50分别为40.9±2.8和18.3±1.6μg/mL。这些结果表明该胶束的细胞毒性是由Cur而非TPE产生的。 综上所述，我们通过FRET和AIE的结合使用成功实现了对氧化还原敏感聚合物胶束中的姜黄素释放的原位监测。引入的AIE分子作为FRET供体可以解决由分子染料聚集而引起的荧光淬灭效应。由GSH或TCEP诱发PBS溶液内药物释放可以引起FRET供体和受体荧光效应的增强，但TCEP在二硫键的断裂上显得更加高效。另外，在MCF-7细胞中也观察到相同的趋势。由于短激发波长的组织穿透能力有限，目前无法在体内进行原位药物释放监测的相关研究。但当药物和AIE探针的激发波长位于近红外范围内时，这种策略可用于原位评估体内药物释放。目前的研究显示了Cur与AIE结合使用的潜力，从而实现对刺激敏感型纳米药物释放的实时监测。

目录

声明

Chapter 1. Introduction

1.1 Nanocarriers as drug delivery systems

1.2Introduction to stimuli-responsive nanocarriers

1.2.1Redox-responsive nanocarriers

1.2.2Other types of stimuli-responsive nanocarriers

1.3Approaches formonitoring drug release from nanocarriers

1.3.1Traditional methods for monitoring drug release

1.3.2Recent advances in monitoring drug release

1.4Introduction to FRET technique

1.4.1FRET principle

1.4.2FRET materials

1.4.3Pharmaceutical application of FRET

1.5Recent advances of AIE molecules

1.5.1AIE mechanisms

1.5.2AIEgens

1.5.3AIE applications

1.6Hypothesis and aim of the project

Chapter 2. Synthesis of amphiphilic polymer-drug conjugated

2.1Materials and instruments

2.1.1Materials

2.1.2Instruments

2.2Synthesis and characterization of TPE-OH

2.2.1Synthesis of TPE-OH

2.2.2Results and discussion

2.3Synthesis and characterization of TPE-COOH

2.3.1Synthesis of TPE-COOH

2.3.2Results and discussion

2.4Synthesis and characterization of Cur-SS

2.4.1Purification of curcumin

2.4.2Synthesis of Cur-SS

2.4.3Results and discussion

2.5Synthesis and characterization of Lys(Z)-NCA

2.5.1Synthesis of Lys(Z)-NCA

2.5.2Results and discussion

2.6Synthesis and characterization of mPEG-PLys(Z)

2.6.1Synthesis of mPEG-PLys(Z)

2.6.2Results and discussion

2.7Synthesis and characterization of mPEG-PLys(Z)-TPE

2.7.1Synthesis of mPEG-PLys(Z)-TPE

2.7.2Results and discussion

2.8Synthesis and characterization of mPEG-PLys-TPE

2.8.1Synthesis of mPEG-PLys-TPE

2.8.2Results and discussion

2.9Synthesis and characterization of mPEG-PLys(Cur)-TPE

2.9.1Synthesis of mPEG-PLys(Cur)-TPE

2.9.2Results and discussion

Chapter 3. Preparation and characterization of polymeric micelles

3.1Materials and instruments

3.1.1Materials

3.1.2 Instruments

3.2Preparation of polymeric micelles

3.3Characterization of polymeric micelles

3.3.1 UV-vis spectra of polymeric micelles

3.3.2Particle size analysis of polymeric micelles

3.3.3Stability of polymeric micelles

3.3.4Fluorescence spectra of polymeric micelles

3.3.5 AIE performance of polymeric micelles

Chapter 4. Drug release from the redox-responsive micelles

4.1 Materials and instruments

4.1.1Materials

4.1.2Instruments

4.2Preparation of sample stocks

4.3Performance of micelles in response to GSH trigger

4.3.1Kinetic emission spectra of TPE and Cur

4.3.2Kinetic absorption spectra

4.3.3Hydrodynamic size analysis

4.3.4Results and discussion

4.4Micelles disassembly in response to TCEP trigger

4.4.1Kinetic emission spectra of TPE and Cur

4.4.2 Kinetic absorption spectra

4.4.3Hydrodynamic size analysis

4.4.4Results and discussion

Chapter 5. Intracellular evaluation of redox-responsive micelles

5.1Materials and instruments

5.1.1Materials

5.1.2Instruments

5.2Cells viability assays

5.2.1The principle of cell viability assay

5.2.2The experimental process

5.2.3Results and discussion

5.3Cellular uptake

5.3.1The experimental process

5.3.2 Results and discussion

5.4Cumulative drug release in cells

5.4.1The experimental process

5.4.2Results and discussion

5.5Quantitative flow cytometry analysis

5.5.1The experimental process

5.5.2Results and discussion

Chapter 6. Conclusions and prospects

6.1Conclusions

6.2 Prospects

参考文献

Publication

致谢