基于多功能二硫化钼纳米载体的肿瘤诊断治疗一体化研究

摘要

恶性肿瘤分为癌和肉瘤，由于其具有无限增殖、易转移、浸润性强的特点，成为医学上的难关之一，逐年攀升的发病率和死亡率严重危害着病人的健康和生命。仅2017年就有新发癌症病例168.9万例，死亡病例60.6万例，相当于每分钟至少有8人死于癌症。肿瘤已成为人类健康和生命的重大威胁，因此早期诊断和规范的治疗显得尤为重要。临床上常用的治疗肿瘤的手段有手术治疗、化学药物治疗、放射治疗治疗。手术作为常见的一种治疗方法，对大多数早期原发性病灶治疗有较好的效果，但对于中、晚期恶性肿瘤的治疗效果并不理想，并且手术治疗对人体还会造成较大的创伤，导致患者的免疫力下降，非常容易引起术后一系列并发症。放射治疗是指利用不同能量的放射性射线照射肿瘤细胞，从而达到杀伤人体病灶部位的肿瘤细胞的作用。但是，放射性治疗的疗效受限于肿瘤组织对放射线的敏感程度，并且在放射性射线杀灭和消除肿瘤细胞的同时，也会对其人体周围的健康组织细胞造成一定的损伤。由于三大传统治疗手段的临床效果受到限制，近年来新兴的具有非侵入、无创伤性的光学治疗方法引起了广大研究员的广泛关注。光学治疗（包括光热治疗和光动力治疗）多选择近红外光作为激发光源，因为近红外光可以渗透组织深部，局部光照可以选择性杀伤肿瘤细胞，避免了对正常组织的毒副作用。 光热治疗（PTT）是近十年兴起的一种治疗方式，是指具有吸收特定波长的光热治疗剂将吸收的光能转化为热能，使受热的组织和细胞受热变形、坏死。由于正常组织和细胞在升高温度的条件下也一定程度上通过血流的加速和血管的扩张进行散热，故正常组织升温到43℃左右受损伤较小。但是肿瘤细胞对热忍受性较低，其组织内新生血管通常是形态异常的血管，内皮细胞敏感易损伤。理想的光热治疗剂应具有较高的光热转化率，具有靶向性、良好的生物相容性、较高的成像性，从而使纳米药物具有能够精准定位病灶部位的能力。光动力治疗(PDT)是一种基于光敏剂（Ce6,Alpc,ZnPc等）在特定波长的激发下产生活性氧从而达到杀伤肿瘤组织的目的，不同于以往的手术治疗、放疗治疗和化学治疗等手段，光动力治疗具有创伤小，毒性低，无耐受性，适用范围广和操作简单等诸多优势。然而，目前光动力治疗在肿瘤治疗方面还存在着一些缺陷，制约了其进一步临床应用。 根据目前临床表现，依靠任何一种单一治疗方式，在短期内无法获得令人满意的效果，多数恶性肿瘤会在治疗一段时间后复发，难以达到彻底根治的目的。为了克服这一难题，众多研究人员专注于多种治疗方式联合治疗的研究。采用联合治疗可以充分利用它们各自不同的作用机制，扬长避短，相辅相成，实现治疗效果最大化，达到协同治疗的目的。目前手术、放疗、化疗、PDT以及PTT治疗之间多种联合应用已取得喜人的效果。许多研究证明，有近红外吸收特性的纳米材料除了可以实现PTT治疗效果外，还可以发挥远端控制药物释放的作用,相对于单一治疗方法，PTT或化疗，二者的联合应用可以起到更有效的抗肿瘤作用。此外，光动力治疗和化疗的联合使用在抗肿瘤临床研究和临床试验都已有较长历史，其中基于纳米载体共同负载化疗药物和光敏剂的方式应用的较广泛。结果显示，PDT和化疗的联合应用能更加有效的发挥抗肿瘤的作用。由于操作简便和非侵入性的治疗特点，使得越来越多地研究者们专注于PTT和PDT的联合应用抗肿瘤治疗的方式。研究发现有近红外吸收的纳米材料常常被用作于光敏剂的载体，这为PTT和PDT的联合治疗提供了一个新的方向。结果显示，该纳米载体在荷瘤小鼠体内抗肿瘤治疗中表现出高效的协同抗肿瘤的作用。 在肿瘤的治疗过程中成像技术是非常重要的。无论是传统的手术、化疗、放疗等方式，还是新兴的光疗方式，在肿瘤治疗前，都需要借助相应的成像技术以确定肿瘤的位置、大小以及药物载体在体内的分布情况；治疗过程中需要成像手段辅助监测肿瘤的治疗情况，为调整治疗方案提供参考和依据；治疗结束后，需要利用成像技术检验治疗的效果和是判断是否需要进一步的治疗。临床上常用的成像诊断技术主要包括超声成像（Ultrasound）、光学成像(Opticalimaging)、核磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)、光声成像（Photoacoustic imaging,PAI）、电子计算机断层扫描（X-ray computertomography,CT）、正电子发射计算机断层扫描（Positron emission tomography,PET）等等。目前单一的诊断手段和治疗技术并不能满足现代医学个性化的需求，通常需要将两种或多种成像技术整合到肿瘤治疗的全过程中，实现多模态成像介导的肿瘤可视化治疗。因此，开发同时具有成像介导作用和可视化治疗的多功能纳米材料，已经成为了当前肿瘤治疗的一大热点。 目前具有良好的光热治疗作用的二硫化钼引起了研究者的广泛关注，同时硫化钼具有CT成像的作用，因此二硫化钼可作为诊疗一体化的试剂。但是单一的光热治疗效果不是很理想，为了达到协同抗肿瘤的目的，通常联合PTT和PDT治疗。同时，在发挥PDT作用的光敏剂（Ce6、Alpc）未被激活前能够在体内实现荧光示踪的作用，从而实现多模态成像指导下的可视化的抗肿瘤。本文围绕基于二硫化钼纳米材料构建了两种诊疗一体化的多功能纳米体系，具体内容如下： （1）针对光动力存在光敏剂特异性低、有潜在长期毒性的缺点，本实验构建了一种负载Ce6的PEG-MoS2-Au的纳米复合物（PEG-MoS2-Au-Ce6）。Ce6通过π-π堆积效应和疏水效应装载到PEG-MoS2-Au的表面，Ce6因与AuNPs的表面等离子体共振和PEG-MoS2纳米板的耦合作用而保持其淬灭态。然而，Ce6在PEG-MoS2-Au杂化物温度触发后从其表面释放出来呈现强烈的NIR荧光信号，故可发挥PDT效应用于抗肿瘤的治疗。此外，PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合材料中的PEG-MoS2纳米片和Ce6可分别进一步用于CT和近红外荧光成像（NIRF）双模式成像。 体外实验结果显示最终制备的PEG-MoS2-Au-Ce6纳米杂化物具有较高的载药量（23.8%±0.15%），粒径为(152±0.2nm),稳定良好，长期放置未见明显聚集和沉淀。通过电感耦合等离子光谱发生仪测得最终制备的纳米复合物中PEG-MoS2：AuNP的确切比重为1∶1.5。光热考察研究表明PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物具有明显的光热升温性能，经808nm激光照射5分钟后最高温度达到59.2℃。在体外近红外光触发释药研究中,表明NIR光诱导的局部高温可以促进Ce6从PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合材料中释放，释药量高达到45%。在体外单线态氧检测中，显示在660nm激光照射3min后DPBF吸光度明显降低，表明PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合材料有着良好的产生单线态氧的能力。 本实验选用4T1细胞考察研究纳米复合物在细胞内的作用。结果表明，与游离的Ce6相比，当Ce6被装载到PEG-MoS2-Au纳米材料上后，其细胞内化水平明显提高了，细胞内活性氧（ROS）检测结果证明PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物可在细胞水平发挥有效的PDT作用。与游离Ce6组对比，发现PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物在给予808和660nm双波长激光照射后，DCFH-DA荧光信号较强，此实验结果表明PTT有诱导PDT效应的作用。MTT研究表明，用于PTT和PDT联合治疗的PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物诱导细胞死亡高达72.3％，表明PTT/PDT的组合效果对癌细胞表现出了明显的抑制作用。通过Calcein AM/PI双染法直观地评价PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物的杀伤肿瘤效果。 本实验还建立了裸鼠肿瘤模型,考察PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物的体内抗肿瘤效果，近红外荧光成像表明注射6h后PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物可以通过高通透性和滞留效应在肿瘤部位聚集并达到最大量。因为PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物高度敏感的CT特性，可通过CT成像技术检测和观察肿瘤区域的分布情况。近红外成像表明PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物高效的体内光热治疗作用。体内治疗肿瘤的评价结果证明了PEG-MoS2-Au-Ce6纳米复合物不仅能显著提高疗效，而且明显降低副作用。 （2）基于对第一个课题的研究，我们惊喜的发现小粒径的MoS2也有很好的光热效果，并且小粒径的MoS2纳米点比MoS2纳米板的水分散性效果更好。但是由于MoS2纳米点的粒径较小，使得其易被肾脏代谢出体内，限制了MoS2纳米点的应用。为了克服上述问题，我们设计将MoS2纳米点包载在SiO2中，从而增加MoS2纳米点在体内的循环时间。此外，由于SiO2介孔结构特性，可以在SiO2的孔道内负载上氯化铝酞菁（Alpc），提高光敏剂的载药量。为了避免Alpc过早的从Alpc-MoS2@SiO2体系中泄漏出来，我们设计在Alpc-MoS2@SiO2的表面包覆上壳聚糖（CS），从而起到门控的效果。因此，本实验构建了一种新型的壳聚糖（CS）包覆的和氯化铝酞菁（Alpc）负载的纳米复合物Alpc-MoS2@SiO2-CS，用于近红外荧光（NIRF）、光声（PA）和X射线计算机断层扫描（CT）多模态成像介导的光热和光动力联合抗肿瘤。CS在酸性条件下质子化，从而引发Alpc从纳米复合物中释放，与组织周围的氧气发生反应产生活性氧而发挥PDT效应达到抗肿瘤的作用。此外，MoS2@SiO2在特定波长的激光照射下产生热以发挥PTT效应。 体外实验结果显示最终制备的Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米杂化物的粒径为98±4.1nm,载药量19%，且分布较均一，纳米杂化物的外观呈形态规整的球形，稳定良好，长期放置未见明显聚集和沉淀。光热考察研究表明Alpc-MoS2@SiO2-CS具有良好的光热升温性能和较好的光热稳定性能。由于在体外PA和CT成像试验表明Alpc-MoS2@SiO2-CS具有良好的PA和CT成像能力，因此Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物可以实现多模态成像指导下的PTT和PDT的联合治疗。在体外单线态氧检测中，显示在660nm激光照射3min后DPBF吸光度明显降低，表明Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合材料有着良好的产生单线态氧的能力。 4T1细胞试验用来考察研究纳米复合物在细胞水平上发挥的作用。细胞内活性氧（ROS）检测结果证明，与游离的Alpc相比,发现Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物在低pH条件下产生活性氧的能力更强，说明了Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物有着肿瘤微环境相应的效果和产生活性氧的能力。通过Calcein-AM/PI双染法直观性的评价Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物的杀伤肿瘤细胞的效果，大量的细胞出现死亡现象。流式细胞分析显示证明了Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物加激光照射后的细胞晚期凋亡和坏死率高达45.5%。MTT研究表明，Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物在低pH条件能够对细胞产生强烈的光毒性，细胞死亡率高达69.7%。 裸鼠肿瘤模型用来考察Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物的体内抗肿瘤效果，近红外荧光成像表明注射8h后Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物可以通过高通透性和滞留效应在肿瘤部位聚集并达到最大量。因为Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物高度敏感的CT和PA特性，可通过CT和PA成像技术检测和观察肿瘤区域的分布情况。近红外成像表明Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物高效的体内光热治疗作用。体内治疗肿瘤的治疗评价结果证明了Alpc-MoS2@SiO2-CS纳米复合物不仅能显著提高疗效，而且对周围正常的组织明显降低副作用。