远红外荧光蛋白smURFP的结构研究

摘要

荧光蛋白（Fluorescent proteins,FPs）对于生物学研究有着极为重要的应用价值，通过荧光蛋白可以观测细胞活动，标记表达蛋白，深入开展蛋白质组学等相关实验，甚至用于肿瘤及癌症检测。在众多荧光蛋白中，远红外荧光蛋白具有背景成像低，可以体内成像等优势，因此受到科研工作者的青睐。SmURFP是通过对TeAPCα中的藻胆蛋白进行多轮突变改造而得到的远红外荧光蛋白，具有高荧光强度，激发与发射光波长为642/670nm，有着重要的研究价值和应用前景。 本文以smURFP为研究对象，通过分子生物学和结构生物学等手段，对smURFP蛋白及其与胆绿素（BV）复合物展开结构生物学研究。我们构建克隆并在原核表达系统（大肠杆菌）中大量表达了smURFP蛋白，通过多种层析方法获得了纯度较高的smURFP蛋白，对smURFP蛋白进行了结晶条件筛选和晶体优化，最终得到质量高、衍射好的smURFP蛋白晶体，通过X射线晶体衍射方法收集了smURFP蛋白2.1分辨率的晶体衍射数据并解析了其三维空间结构。荧光强度检测数据显示，smURFP蛋白在不需要辅助酶的存在下，可以很好的结合BV，具有活性。但目前尚未得到高质量、衍射数据较好的复合物晶体。 本课题希望通过解析smURFP蛋白及与BV结合复合物的三维空间结构，揭示该蛋白在原子分辨率水平上活性中心的关键特征，发现该蛋白与发色团相互作用的荧光机制。为今后进一步修饰改造smURFP，寻找和开发更多发色团提供重要的结构信息，进而得到荧光强度更高的荧光蛋白。

目录

声明

第1章 引言

1.1 红色荧光蛋白与远红外荧光蛋白

1.1.1 红色荧光蛋白的特性

1.1.2 远红外荧光蛋白的特性

1.1.3 红色荧光蛋白和远红外荧光蛋白的进化关系

1.2 红色荧光蛋白的相关应用

1.2.1 显像技术

1.2.2 生物传感器和双分子荧光互补

1.2.3 深部组织成像

1.2.4 报告基因

1.3 红色荧光蛋白结构和机制

1.3.1 蛋白结构和机制

1.3.2 保守的发色团共价结构

1.4 smURFP蛋白的简介和特性

1.5 研究内容与意义

第2章 smURFP的蛋白制备

2.1 实验材料

2.1.1 实验仪器及实验耗材

2.1.2 实验菌株与实验质粒

2.1.3 实验工具酶与实验试剂

2.1.4 常用培养基及缓冲液配置

2.2 实验原理

2.2.1 蛋白质的表达

2.2.2 蛋白质的纯化

2.3 实验方法

2.3.1 smURFP基本信息

2.3.2 smURFP蛋白表达载体构建

2.3.3 smURFP蛋白的表达

2.3.4 smURFP蛋白的纯化

2.4 实验结果

2.4.1 smURFP蛋白表达载体构建

2.4.2 smURFP蛋白的表达和纯化

第3章 smURFP的荧光活性研究

3.1 荧光测定实验原理

3.2 实验方法

3.3 实验结果

第4章 smURFP的结构研究

4.1 实验原理

4.1.1 蛋白结晶学

4.1.2 结构解析原理

4.2 实验方法

4.2.1 smURFP蛋白的结晶

4.2.2 smURFP蛋白晶体的衍射数据收集与处理

4.2.3 smURFP蛋白晶体的分子置换法结构解析

4.3 实验结果

4.3.1 smURFP蛋白的结晶

4.3.2 smURFP蛋白晶体的衍射数据收集与处理

4.3.3 smURFP蛋白晶体的分子置换法结构解析

4.3.4 smURFP的高分辨率三维空间结构

第5章 smURFP与BV的复合物结构研究

5.1 实验原理

5.2 实验方法

5.2.1 smURFP蛋白与BV的孵育结晶

5.2.2 smURFP蛋白与亚铁血红素氧化酶1蛋白的共表达

5.3 实验结果

5.3.1 smURFP蛋白与BV的孵育结晶

5.3.2 smURFP蛋白与亚铁血红素氧化酶1蛋白的共表达

第6章 结论和意义

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

发表论文

致谢