假单胞菌ND6菌株儿茶酚2，3-双加氧酶的性质和蛋白质工程研究

摘要

该实验室分离到的假单胞菌ND6是一个萘降解菌株,其萘降解基因位于一个102kb的质粒pND6-1上.其中的儿茶酚2,3-双加氧酶基因(nahH)已被克隆到大肠杆菌中.该研究对此基因表达产物C230进行纯化,测定其酶活及耐热性,并与国外报道的萘降解质粒NAH7中nahH基因编码的酶进行对比.结果表明,ND6菌株中的C230酶活力更高,耐热性更好.用PCR方法从环境污染物中分离C23O基因的中间片段和pND6-1质粒的C23O基因两端片段,再通过第二轮PCR将三个片段相连,得到杂合的nahH基因.希望通过这种盒式PCR(cassette-PCR)的方法得到性能更加优越的儿茶酚2,3-双加氧酶.该研究将NAH7的nahH基因中间片段与pND6-1质粒的C23O基因两端片段相连得到了一个杂合的nahH基因,并克隆到大肠杆菌中进行表达,纯化表达产物,杂合的C23O具有较高的酶活.

目录

摘要

ABSTRACT

第一部分前言

2萘的生物降解

3 nahH基因的广泛分布和进化关系

4 C23O蛋白的研究

5 Cassette PCR与酶分子的定向进化

第二部分材料和方法

1 试剂

2 仪器

3 软件与网页

4 菌株和质粒

5 培养基和培养条件

7 NahH蛋白的表达及纯化

8 蛋白质测定

9用Cassette PCR方法制备杂合nahH基因

第三部分结果与讨论

1 C23O-N与C23O-G的序列比较

2 C23O-N的纯化与活力测定

3杂合nahH基因的构建和性质

结论

参考文献

致谢