肝癌转移亚细胞系的建立及分离肝癌转移相关基因和蛋白的研究

摘要

该研究采用人肝癌细胞H7402,腋后背部皮下接种SCID鼠,接种后7天时成瘤,接种后66天时,在荷瘤鼠赢弱时引颈处死,取其肺组织,进行原代和传代细胞培养,传代10代以后,细胞形态不变,且可以连续传代,将该细胞系命名为M-H7402.然后,对M-H7402细胞进行了生物学鉴定,检测了细胞形态、染色体、细胞动力学、细胞周期、甲胎蛋白表达、癌基因表达、转移相关基因表达和细胞回接SCID鼠成瘤实验等指标.结果显示M-H7402细胞的生长、增殖和形态等与亲本细胞H7402十分相近,其染色体形态仍为人类核型,众数维持在72~80之间,占75.0﹪.RT-PCR检测M-H7402细胞甲胎蛋白的表达,结果为阳性.Western blot检测结果显示:与H-7402细胞相比,M-H7402细胞癌基因c-myc表达水平较高,转移抑制基因nm23的表达水平明显下调,确定M-H7402细胞为亲本细胞H7402的亚克隆细胞.应用SCID鼠筛选获得的肝癌转移亚细胞系M-H7402,与亲本细胞系H7402形成了配对关系.在上述研究基础上,该研究采用配对细胞H7402和M-H7402,运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),筛选差异表达的基因.结果筛选出9条较明显的差异表达片段,将其中一条在M-H7402细胞中表达较高的差异片段M10和一条在H7402细胞中表达较高的差异片段M2进行克隆和测序,测序结果与GenBank进行同源比较,显示M10片段为PolyA结合蛋白,M2片段为Rab5a.然后,又经RT-PCR和Western Blot进一步证实,显示与DDRT-PCR结果相符.有文献报道,PolyA结合蛋白能够影响mRNA的稳定性,在调节细胞转运方面具有重要的作用.Rab5a为ras GTP结合蛋白,与细胞内物质运输、蛋白分选相关,而且与信号传导、受体下调和病原体吞噬有关.该研究发现在M-H7402细胞中PolyA结合蛋白表达上调,Rab5a表达下调,提示PolyA结合蛋白和Rab5a可能与肝癌转移有关.该研究进一步运用蛋白质组学技术从蛋白水平上分离肝癌转移相关蛋白.运用二维电泳技术,比较了M-H7402细胞和亲本H7402细胞的全蛋白,发现3个在M-H7402细胞中上调表达的蛋白质点,分别标记为MP1、MP2和MP3,差异蛋白质点经ESI-QUAD-TOF质谱分析后,通过与蛋白数据库比较,初步确定MP1为原肌球蛋白(Tropomyosin),MP2为波形纤维蛋白(Vimentin),MP3为热休克蛋白70(Heat shock 70KDa protein,HSP70).原肌球蛋白是肌动蛋白的结合蛋白,波形纤维蛋白是一种细胞骨架蛋白,热休克蛋白70是一种肿瘤相关蛋白,三种蛋白在肝癌转移细胞M-H7402的上调表达,提示可能与肝癌转移有关,其功能有待于进一步证实.

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

前言

1.肿瘤转移

2.肿瘤转移模型和转移细胞系的建立

3.mRNA差异显示技术

4.蛋白质组学

实验目的和意义

第一部分肝癌转移亚细胞系M-H7402的建立

1.实验材料

2.实验方法

2.1接种SCID鼠

2.2原代培养

2.3传代培养

2.4细胞纯化

2.5细胞冻存

2.6细胞复苏

2.7M-H7402细胞系的鉴定

3.实验结果

3.1病理学结果

3.2细胞形态学

3.3染色体分析

3.4细胞动力学

3.5细胞周期检测

3.6RT-PCR检测AFP的表达

3.7肿瘤相关蛋白WesternBlot检测结果

3.8M-H7402细胞回接SCID鼠成瘤实验

第二部分运用mRNA差异显示技术分离肝癌转移相关基因

1.实验材料

2.实验方法

2.1细胞培养

2.2细胞总RNA的提取

2.3DNase处理RNA样品

2.4RNA质量检测

2.5mRNA差异显示

2.6差异片段的克隆及鉴定

2.7差异片段的验证

2.8Rab5a细胞免疫荧光定位

2.9Rab5a全长的构建

3.实验结果

3.1RNA检测结果

3.2银染mRNA差异显示结果

3.3差异表达基因的二次PCR

3.4差异表达基因克隆的酶切鉴定

3.5克隆片段的序列分析

3.6RT-PCR验证M10差异表达结果

3.7WesternBlot验证M2差异表达结果

3.8Rab5a细胞免疫荧光结果

3.9全长Rab5a的构建

第三部分运用蛋白质组学技术分离肝癌转移相关蛋白

1.实验材料

2.实验方法

2.1样品制备

2.2蛋白质浓度测定

2.3一维等电聚焦电泳

2.4IPG胶条的平衡

2.5二维SDS-PAGE

2.6考马斯亮蓝染色

2.7脱色

2.8ESI-QUAD-TOF质谱分析

3实验结果

3.12-DE分离蛋白质结果

3.2ESI-QUAD-TOF质谱分析结果

讨论

1.肝癌转移细胞系的建立及其生物学鉴定

2.肝癌转移相关基因的分离及验证

3.蛋白质组学技术分离肝癌转移相关蛋白

小结

参考文献

附录1溶液配制

附录2发表论文及专利

致谢