表达中国HIV-1 B'/C毒株env嵌合病毒SHIV的构建及生物活性研究

摘要

人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)与猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)同属于反转录病毒科慢病毒属,两者的亲缘关系在慢病毒属中最接近.SHIV,即SIV/HIV嵌合病毒,是利用基因重组技术,将SIV和HIV的相应基因进行置换而构建出来的重组嵌合病毒.该文以SHIV-89.6P的克隆株SHIV-KB9为主要骨架,将gp120和部分gp41(从N末端的50到650个氨基酸)的KpnⅠ-AvrⅡ基因片段用中国HIV-1毒株的相应区域进行替换,构建了50个携带中国主要流行亚型B'/C不同毒株env基因的SHIV cDNA嵌合克隆.分别将这些重组病毒cDNA转染293T细胞,收集病毒上清感染人的PBMC细胞,对所有克隆的生物学活性进行体外鉴定.通过SIVp27衣壳蛋白滴定检测,筛选到具有感染活性的SHIV cDNA克隆SHIV-XJ02170.透射电镜观察到SHIV-XJ02170和SHIV-CN97001 cDNA克隆在293T转染细胞系中包装出病毒颗粒;DNA PCR检测到这两个病毒已成功整合到人、恒河猴和食蟹猕猴PBMC的基因组中;RT-PCR检测到两个病毒在人、恒河猴和食蟹猕猴PBMC培养上清中gag-pol RNA转录本和(或)RNA基因组的形成;SIV p27衣壳蛋白滴定描绘出它们在人、恒河猴和食蟹猕猴PBMC中的复制动力曲线;被SHIV-XJ02170和SHIV-CN97001感染过的恒河猴PBMC出现明显的细胞病变;表达不同辅助受体的细胞系确定SHIV-XJ02170和SHIV-CN97001是具有CCR5嗜性的病毒.动物实验的初步结果表明:SHIV-XJ02170可以在第一代恒河猴405中进行复制;SHIV-CN97001可在第一代的恒河猴025853、024854和第二代恒河猴028884、024901中有效复制.

目录

Abstract

前言

1.1 HIV的研究概况

1.1.1 HIV的病毒颗粒形态

1.1.2 HIV基因组结构及功能

1.1.3 HIV的生活周期

1.1.4 HIV的药物治疗

1.1.5 HIV的疫苗研究

1.1.6 HIV的流行病学研究

1.2 SIV研究概况及其与HIV的比较

1.2.1 SIV的研究概况

1.2.2 SIV和HIV的相同点

1.2.3 SIV和HIV的不同点

1.3 SHIV研究进展及构建策略

1.3.1 HIV疫苗研制需要合适的动物模型

1.3.2 SHIV病毒的构建及特征

1.3.3 SHIV在AIDS疫苗研究中的应用

1.4本研究的目的和意义

1.4.1立题依据

1.4.2本研究的目的和意义

材料与方法

1实验材料

1.1菌株

1.2细胞

1.3质粒

1.4主要工具酶和试剂

1.5主要仪器和设备

1.6 HIV标本来源及亚型分类

2实验方法

2.1 HIV感染者基因组DNA的提取及目的基因的扩增

2.2 SHIV cDNA克隆的构建

2.3细胞培养

2.4感染性SHIV cDNA克隆的筛选

2.5 SHIV p27衣壳蛋白滴度检测

2.6基因组DNA的提取及DNA-PCR

2.7 RNA的提取及RT-PCR

2.8病毒颗粒电镜照片观察

2.9感染细胞病变观察

2.10 HIV-XJ02170亚型分类

2.11细胞嗜性的测定

2.12猴体动物实验

结果与分析

1以SHIV-KB9为主体的中国SHIV-XJ02170的构建

1.1重组SHIV-XJ02170克隆的构建策略及基因组结构组成

1.2目的基因的获得

1.3含有中国HIV-1 env基因的半长SHIV克隆的筛选和鉴定

1.4全长SHIV克隆的构建和鉴定

1.5具有复制能力的SHIV-XJ02170的筛选

1.6 HIV-XJ02170的背景资料和亚型分类

1.7 SHIV-XJ02170的细胞活性分析

1.9 SHIV-XJ02170的细胞嗜性测定

1.10 SHIV-XJ02170在恒河猴体内复制的初步检测

2以SHIV-KB9为主体的中国SHIV-CN97001的构建

2.1重组SHIV-克隆的构建策略及基因组结构组成

2.2全长SHIV-CN97001克隆的构建、筛选和鉴定

2.3 SHIV-CN97001在PBMC细胞中的活性分析

2.4 SHIV-CN97001的恒河猴体内实验

讨论

1感染性SHIV嵌合病毒成功构建的关键

2成功构建的SHIV嵌合病毒的类型及衍生关系

2.1已报道的SHIV嵌合病毒的类型

2.2各类SHIV毒株之间的衍生关系

3 SHIV嵌合病毒在恒河猴动物模型中的应用

总结与展望

参考文献

附录

致谢