用植物叶绿体为生物反应器表达重要外源蛋白的研究

摘要

用植物为生物反应器生产外源重组蛋白已成为生物技术研究的新领域。在植物中表达外源重组蛋白具有遗传操作简单、生产成本低、无动物病毒和细菌毒素污染等优点。近几年发展起来的植物叶绿体转化技术可使外源基因定向导入叶绿体基因组中并实现表达。叶绿体遗传转化与传统的核转化相比具有许多优点，如高效表达外源基因；通过同源重组定点整合方式导入外源基因消除了位置效应及基因沉默；能同时进行多基因表达；母系遗传方式可防止外源基因通过花粉扩散等。因此，利用植物叶绿体为生物反应器生产动物口服疫苗、细胞生长因子及工农业酶制剂成为生物工程领域研究的热点。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞植物，素有“绿色酵母”(green yeast)之称，其含有一个单一约占整个细胞体积40％的大型杯状叶绿体，且与质膜紧贴，使外源基因的转化和转化后的同质化过程较为容易。因此，衣藻叶绿体是表达外源蛋白质的理想材料。 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)，亦称Apo-2L，是新发现的又一肿瘤坏死因子超家族成员，它能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性，这一特点显示TRAIL是一种新的抗肿瘤药物，在肿瘤治疗中有着潜在的、广泛应用前景。我们选择衣藻叶绿体基因组 clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2为同源重组片段，壮观霉素抗性基因为选择标记，构建了编码TRAIL胞外区可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣藻叶绿体表达载体p64TRAIL，通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中，经壮观霉素抗性筛选，获得了3个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后，经PCR、Southern blot检测分析及暗培养，证实sTRAIL编码区DNA整合到衣藻叶绿体基因组中，Westernblot检测分析表明sTRAIL编码区在衣藻叶绿体中获得了表达。Western blot影像摄录分析表明，表达的sTRAIL蛋白占衣藻细胞可溶性总蛋白的0.43％-0.67％。实验结果证明用衣藻叶绿体为生物反应器生产医药蛋白是可行的。 来源于 Pyrococcus．furiosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶，在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。 本实验室构建了来源于Prococcus.furiosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中，经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选，获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后，经PCR、Southern blot检测分析及暗培养，证明耐高温α-淀粉酶基因整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明，转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性，最高达77.5U/g鲜重衣藻。用植物为生物反应器生产动物口服疫苗是一条安全、有效、廉价的动物疫苗生产新途径。营养丰富，适口性好的豆科牧草是表达植物性动物食用疫苗的首选受体植物，表达的疫苗无须提取纯化，可以直接食用免疫。口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄目动物强烈传染病。口蹄疫病毒表面主要保护性抗原基因VP1编码的囊膜糖蛋白可诱导机体产生中和抗体，保护动物免受病毒侵袭。为了开辟生产口蹄疫疫苗的新途径，我们构建了两种口蹄疫病毒主要保护性抗原基因VP1与强黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基(CTB)的融合基因CTBVP1在优良豆科牧草百脉根叶绿体基因组中定点整合表达载体。通过对百脉根叶绿体基因组的分析，选择合适的外源基因在其中的整合位点，并设计引物用PCR 方法扩增了两对叶绿体基因组同源片段psbA、trnK和rbcL、atpB，构建百脉根特异的叶绿体转化通用载体pAK和pLB；选择叶绿体基因特异的强启动子Prrn和终止子TpsbA为调控序列，构建了包含CTBVP1融合基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒的百脉根叶绿体定点整合载体pAKCV和pLBCV；经PCR和酶切验证，所构建的转化载体符合预期设计。百脉根叶绿体转化载体的合理构建为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定了基础。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节植物生物反应器生产异源蛋白

1.1.1植物生物反应器的优点

1.1.2利用植物生物反应器生产异源蛋白质

1.1.3植物生物反应器存在的问题

1.1.4植物生产外源蛋白的新策略

第二节叶绿体及其基因组的遗传转化

1.2.1叶绿体基因组及其特点

1.2.2叶绿体遗传转化原理

1.2.3.叶绿体遗传转化的特点及优点

1.2.4叶绿体转化载体的构建

1.2.5叶绿体遗传转化的筛选标记基因

1.2.6叶绿体遗传转化方法

1.2.7提高转化效率、促进同质化的方法

1.2.8叶绿体遗传转化的应用研究进展

1.2.9叶绿体遗传转化亟待解决的主要问题

第三节绿色酵母——衣藻

1.3.1莱茵衣藻的生物学特征

1.3.2莱茵衣藻叶绿体分子遗传学特点

1.3.3莱茵衣藻叶绿体遗传转化研究进展

第四节本研究在衣藻叶绿体中表达的两种外源蛋白质

1.4.1肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)

1.4.2来源于嗜热火球菌Pyrococcus furious的耐高温α-淀粉酶

第五节实验研究方案和设计思路

1.5.1本研究的目的和意义

1.5.2研究内容及实验方案

第二章材料与方法

第一节实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3分子生物学试剂及实验引物

2.1.4实验用培养基

第二节实验方法

2.2.1分子操作及载体构建

2.2.2衣藻叶绿体的基因枪转化

2.2.3转基因衣藻的筛选及获得

2.2.4莱茵衣藻核酸的提取及定量

2.2.5叶绿体转基因衣藻的PCR检测

2.2.6叶绿体转基因衣藻的同质化程度的PCR检测

2.2.7 PCR-Southern blot检测

2.2.8莱茵衣藻总蛋白质的提取与定量

2.2.9蛋白质电泳(SDS-PAGE)及凝胶染色

2.2.10 转基因衣藻表达sTRAIL蛋白的Western blot检测

2.2.11 sTRAIL蛋白的扫描定量分析

2.2.12耐高温淀粉酶活性测定

2.2.13叶绿体转基因衣藻的黑暗培养及表型分析

2.2.14转基因对衣藻生长的影响

第三章实验结果与分析

第一节人sTRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达

3.1.1人sTRAIL基因衣藻叶绿体转化载体的构建

3.1.2衣藻叶绿体转化质粒p64TRAIL的酶切、PCR及测序鉴定

3.1.3衣藻叶绿体的转化及转基因衣藻的获得

3.1.4转基因衣藻的PCR鉴定

3.1.5同质化转基因衣藻的获得

3.1.6 PCR-Southern blot检测

3.1.7转基因衣藻的表型分析

3.1.8 sTRAIL基因在衣藻叶绿体中的表达分析

3.1.9 Western blot及定量分析

3.1.10转基因对衣藻生长的影响

第二节来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

3.2.1耐高温淀粉酶amy基因衣藻叶绿体转化载体的构建

3.2.2衣藻转化质粒p64A的酶切、PCR及测序鉴定

3.2.3衣藻叶绿体的转化及转基因衣藻的获得

3.2.4转基因衣藻的PCR鉴定

3.2.5同质化转基因衣藻的获得

3.2.6 PCR-Southern blot检测

3.2.7转基因衣藻的表型分析

3.2.8 amy基因在衣藻叶绿体中的表达分析

3.2.9耐高温淀粉酶活性测定

3.2.10转基因对衣藻生长的影响

第四章口蹄疫病毒VP1抗原基因百脉根叶绿体转化载体的构建及其转化

第一节口蹄疫及其疫苗研究进展

4.1.1口蹄疫及口蹄疫病毒介绍

4.1.2口蹄疫疫苗研究进展

4.1.3口蹄疫植物口服疫苗的研究

4.1.4植物食用疫苗的免疫作用机制

4.1.5口服疫苗的免疫佐剂

第二节本研究的设计思路及实验方案

4.2.1研究的目的和意义

4.2.2实验设计方案与技术路线

第三节实验材料与方法

4.3.1植物材料

4.3.2菌株及载体

4.3.3实验用培养基

4.3.4实验引物

4.3.5分子操作及载体构建

4.3.6百脉根叶绿体DNA提取(高离子强度代pH法)

4.3.7同源片段PCR扩增

4.3.8百脉根无菌苗的获得及外植体的准备

4.3.9百脉根叶绿体的基因枪转化

4.3.10转化叶片的过渡培养及抗性筛选培养

第四节结果与分析

4.4.1百脉根对不同抗生素的敏感性实验及临界浓度的确定

4.4.2 CTBVP1融合基因百脉根叶绿体定点整合载体pAKCV的构建

4.4.3 CTBVP1融合基因百脉根叶绿体定点整合载体pLBCV的构建

4.4.4百脉根叶绿体的基因枪转化及叶绿体转化植株的筛选

第五章讨论

第一节外源基因在衣藻叶绿体中的表达

第二节百脉根叶绿体定点转化载体的构建及转化

5.2.1百脉根叶绿体定点转化载体的构建

5.2.2百脉根的再生体系还需要优化

致谢

参考文献

个人简历及攻读博士学位期间发表的论文