部分落叶松属植物重复序列及分子核型的研究

摘要

落叶松属(Larix)是松科(Pinaceae)中较进化且分布广泛的一个属，对该属进行基因组组成和结构分析，对于研究松科乃至整个裸子植物类群的基因组进化和物种系统发育具有重要的意义。迄今为止，对落叶松属的细胞学研究仍停留在早期的常规核型分析和简单的染色体荧光分带水平，分子细胞遗传学方向的研究相对贫乏。本文以多种不同的基因组重复序列为切入点，对落叶松属的兴安落叶松(Larix gmelinii)、华北落叶松(L. principis-rupprechtii)、日本落叶松(L．kaempferi)和长白落叶松(L .olgensis)的基因组组构特点及精细核型结构进行了研究。包括45S和5S核糖体RNA基因及落叶松属染色体DAPI带纹区域特异序列LPD串联重复序列的染色体物理定位，端粒序列和高拷贝DNA重复序列的分离和鉴定，以及最后将以上各种重复序列作为探针，应用多色荧光原位杂交技术，对这4种落叶松体细胞中期染色体进行了综合荧光标记，构建了落叶松属植物的分子核型。具体研究结果归纳为以下三个部分： 1．应用不对称PCR分析的方法，以包含5个重复单元的拟南芥型端粒重复序列(TITAGGG)5和(CCCTAAA)<,5>分别为单引物，从兴安落叶松基因组中进行扩增，分离并克隆了若干单一片段，对其中的4个克隆LTA14、LTB2、LTB15和LTB28进行了多方面的鉴定。核酸分子组成和Southem杂交分析表明，这4个克隆均含有一定比例的拟南芥型端粒重复序列和其简并序列，并广泛存在于整个落叶松基因组中；核酸序列中AT含量为58.8％～63.4％。FISH定位分析显示，LTA14和LTB2在整个基因组中具有较弱的弥散信号，在所有染色体端部呈现双点状信号，在染色体臂间部具特异性条带信号；LTB15均匀地弥散存在于整个基因组；LTB28仅在染色体末端具较弱的双点状信号。以上结果说明落叶松属的染色体端粒部位的DNA序列很可能仍主要由拟南芥型TRS组成，但含量较低，可能在进化过程中，大部分重复单元发生了变异或退化。 2．发展了PCR分析与分子杂交分析相结合分离高拷贝重复序列的策略，从日本落叶松基因组中，首先以十碱基寡核苷酸引物进行随机PCR扩增，得到206条不同的扩增片段；应用相继进行的斑点杂交、Southern杂交和克隆策略对这些片段进行筛选，最终得到6个含有高拷贝重复序列的克隆LRA82.1、LRA82.2、LRA98、LRA129、LRA241.3和LRA427。将这6个克隆在GenBank数据库中进行比对，未发现同源序列，但其中的LRA82．1、LRA82．2、LRA98间存在300bp～400 bp的同源区段。SolJthern杂交分析显示，6个LRA克隆均为弥散型重复序列片段，并保守地存在于落叶松属各个种中，但不同种间的拷贝数略有差异。FISH定位结果显示，6个克隆均存在弥散分布信号，其中LRA241-3均匀分布于整个基因组；LRA82．1、LRA82.2、LRA98在染色体组中的若干区域存在缺失，这些区域为SC和部分染色体着丝粒；LRA129和LRA427则在染色体特定区域存在扩增而呈现出较强的条带模式信号。 3．常规核型分析显示，落叶松属不同种之间具有保守的二型核型，包括一组由12条中部着丝粒染色体组成的长染色体群和一组由12条近中部着丝粒或近端部着丝粒染色体组成的中长染色体群，核型公式可以统一为2n=2x=12m+ 10sm+2sm (2st)。以25S和5S rDNA、LPD序列、端粒序列克隆LTA14和弥散型重复序列克隆LRA427等5种探针，分组混合后，分两次与相同的细胞进行多色荧光原位杂交。各种探针在不同染色体上产生了不同排列组合的标记模式，使几乎全部的染色体可以被区分。在此过程中，本研究首次将组和标记探针方法应用于植物分子核型构建和裸子植物的分子细胞遗传学研究。以兴安落叶松为参照，设定了统一的落叶松属分子核型标准模式，将不同落叶松的染色体分为12组，同组内染色体视为同源或部分同源染色体。在这个标准中，我们可以最终确定以上各种重复序列在落叶松中的染色体定位，其中，45S rDNA位点分别位于3号、4号和8号(日本落叶松除外)染色体的SC，5S rDNA位于3号染色体短臂近端部区域；4个种的10号染色体不具LPD序列位点，而兴安落叶松和华北落叶松中的11号染色体则具不稳定LPD序列位点；LRA427克隆则分别在1号、7号、8号(日本落叶松特有)、10号、11号(兴安落叶松和华北落叶松)和12号染色体上具有特异扩增条带信号。 本研究进一步将以上研究结果与其它松科植物进行了比较，对落叶松属基因组组构及系统位置进行了初步探索；应用构建的分子核型，进行了种间核型比较，并证明分子核型分析可以为种属问的系统发育关系研究提供非常有价值的线索。另一方面，通过在落叶松属进行构建分子核型的尝试，建立了一套完整而系统的针对具有大染色体植物进行精细核型分析的模式策略。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词

声明

第一章前言

第一节植物重复序列研究进展

1.1.1概述

1.1.2重复序列的分类、特点及其功能

1.1.3重复序列的克隆

1.1.4重复序列在植物分子细胞遗传学研究中的应用

第二节植物染色体分子核型技术研究进展

1.2.1概述

1.2.2分子核型相关技术的发展及构建策略

1.2.3分子核型技术在植物研究中的应用

1.2.4植物分子核型技术存在的问题及展望

第三节针叶树分子细胞遗传学研究进展

1.3.1概述

1.3.2针叶树基因组组构特点

1.3.3针叶树基因组重复序列及精绌核型研究

1.3.4落叶松属分子细胞遗传学研究进展

1.3.5针叶树分子细胞遗传学研究展望

第四节本文选题的依据、意义及研究内容

1.4.1选题意义及依据

1.4.2研究目的及内容

第二章材料与方法

第一节实验材料

第二节实验试剂

第三节实验仪器

第四节实验方法

2.4.1染色体标本制备

2.4.2常规核型分析

2.4.3 25S rDNA和5S rDNA探针制备

2.4.4 45S rDNA探针制备

2.4.5拟南芥型端粒重复序列制备

2.4.6落叶松属基因组DNA提取

2.4.7落叶松属ITS序列PCR扩增

2.4.8 PCR扩增产物克隆和测序

2.4.9 LPD序列探针制备

2.4.10落叶松端粒序列分离和鉴定

2.4.11落叶松端粒序列基因组组构Southern杂交分析

2.4.12落叶松基因组随机引物PCR扩增

2.4.13随机引物PCR产物中候选重复序列的筛选

2.4.14候选重复序列Southern杂交分析

2.4.15染色体荧光原位杂交

2.4.16落叶松属分子核型构建

第三章结果与分析

第一节落叶松属植物核型分析

3.1.1中期染色体标本制备

3.1.2核型数据分析

3.1.3种间核型对称性分析和比较

第二节核糖体RNA基因和LPD序列定位及DAPI分带

3.2.1核糖体RNA基因在落叶松基因组中的定位

3.2.2落叶松属中期染色体的DAPI带型

3.2.3 LPD序列在落叶松基因组中的定位

3.2.4组合标记探针技术在落叶松属植物中的尝试

第三节落叶松属端粒序列的分离与鉴定

3.3.1拟南芥型端粒重复序列扩增与定位

3.3.2落叶松属端粒序列的分离与鉴定

3.3.3落叶松属端粒序列单一片段的分离

3.3.4落叶松属端粒序列克隆的FISH定位及筛选

3.3.5落叶松属端粒序列克隆的核酸序列分析

3.3.6落叶松属端粒序列的基因组组构分析

第四节落叶松属重复序列的筛选与鉴定

3.4.1日本落叶松基因组随机引物扩增

3.4.2随机扩增产物中重复序列片段的筛选

3.4.3单一重复序列候选片段的分离和核酸序列分析

3.4.4重复序列片段的FISH鉴定

3.4.5重复序列片段基因组组构和保守性分析

第五节落叶松属分子核型的构建

3.5.1探针的选择和多色FISH信号图像的合成

3.5.2 同源染色体配对和染色体组的排列

3.5.3四种落叶松属植物分子核型的比较

第四章讨论

第一节落叶松属分子核型研究的意义

第二节落叶松属分子核型构建策略和关键技术分析

4.2.1以多种不同重复序列探针构建分子核型策略的确立

4.2.2 PCR分析结合分子杂交技术在筛选落叶松属重复序列中的应用

4.2.3落叶松属体细胞中期染色体标本制备的技术改良

4.2.4组合标记探针技术在构建落叶松属分子核型中的应用

4.2.5多色FISH和重复杂交策略应注意的问题

第三节落叶松属重复序列基因组组构特点

4.3.1 rDNA在落叶松属基因组中的分布及与其它针叶树的比较

4.3.2 DAPI带型和LPD序列在落叶松属基因组中的分布

4.3.3落叶松属端粒序列

4.3.4 LRA重复序列

第四节落叶松属种间核型比较

第五节后续的研究工作

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历