天蓝黄链霉菌及其产生的新型α-淀粉酶抑制剂研究

摘要

口服α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂能直接延缓肠道中淀粉的消化和吸收,进而有效降低餐后高血糖,因此已成为最便捷安全有效的一线降糖药物之一。目前市售α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂主要是阿卡波糖的各类制品,其专利为国外机构所有。而目前国内的α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂制品也多是阿卡波糖的仿制品,竞争力较低。因此开发具有自主知识产权的,生物活性更强的新型α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂具有非常广阔的应用前景。 本研究从糖的消化、吸收、代谢途径入手,建立了α-淀粉酶/糖苷酶抑制药物的高通量筛选模型,并利用该模型对1000余株土壤放线菌的代谢产物进行了广泛筛选,获得了数株能够产生α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂的菌株。经复筛确认后,最终选择了一株链霉菌,即菌株ZG0656作为后续研究的出发菌株。 本研究首先对菌株ZG0656生物学分类地位的归属进行研究。根据形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成特征和16S rDNA全序列相似性比较分析等多相分类方法,确认菌株ZG0656为天蓝黄链霉菌的新变种,命名为天蓝黄链霉菌南开变种(Streptomyces coelicoflavus var.nankaiensis)。该菌株的特征性菌核样特化结构在链霉菌属中比较罕见。 其次,本研究在10L发酵罐水平对菌株ZG0656进行发酵培养。结果表明,发酵液中可积累一定量的α-淀粉酶抑制剂,发酵产物属于典型的次级代谢类型。采用浓缩,树脂吸附,凝胶过滤,减压干燥等方法得到了α-淀粉酶抑制剂混合物AIB656。经初步分析,确认AIB656为含氮的拟低聚糖类物质,能强烈抑制哺乳动物来源的α-淀粉酶,对餐后高血糖的形成有明显改善作用。 利用半制备型高效液相色谱(HPLC)从α-淀粉酶抑制剂混合物AIB656中分离得到6个化学单体。采用酸水解、质谱分析(MS)和核磁共振光谱分析(NMR)等技术,对它们进行了化学结构鉴定,并命名如下：阿卡他定Ⅰ03(1):m=0,n=1,q=2 阿卡他定Ⅱ03(2):m=0,n=2,q=2 *阿卡他定Ⅲ03(3):m=0,n=3,q=2 *木阿卡他定Ⅳ03(4):m=0,n=4,q=2 *阿卡他定Ⅱ23(5):m=2,n=2,q=2 *阿卡他定Ⅱ13(6):m=1,n=2,q=2。 (*为新化合物)采用酶促反应动力学Dixon曲线作图法,证实每一个阿卡他定单体均是α-淀粉酶的混合型非竞争性抑制剂。通过对抑制常数的比较,发现含有9～12个糖环的阿卡他定分子相对抑制强度最高。其中阿卡他定Ⅲ03是迄今发现的综合抑制效果最强的α-淀粉酶抑制剂,其相对抑制强度为阿卡波糖的260倍。在离体水平和体内水平的实验中,阿卡他定Ⅲ03在同剂量的条件下,表现出和阿卡波糖相同的抑制餐后血糖升高的能力,故可将其应用于α-淀粉酶抑制剂类新型药物的开发。最后,本研究以上述六个已知阿卡他定作为对照品,通过分析它们的色谱行为和质谱裂解规律,建立了一个快速、灵敏、简便的超高效液相色谱-电喷雾质谱联用(UPLC/ESI-MS/MS)分析系统。该系统可用于分离和鉴别其它未知阿卡他定家族化合物。利用该分析系统,对菌株ZG0656的阿卡他定家族次级代谢物组进行了轮廓描述。共描述了80个阿卡他定家族化合物的轮廓,包括15个已知化合物和65个新化合物。在这些首次报道的化合物中,包括一些比较新颖和独特的化学结构类型,如含有5个假三糖核心单位的结构类型,直接以脱氧葡萄糖在还原端结尾的结构类型,非还原端缺少一个环醇残基的结构类型,等等。 本研究利用高通量筛选模型筛选得到了一株产生α-淀粉酶抑制剂的天然菌株ZG0656。将其作为出发菌株,系统研究了其分类地位,发酵培养,产物提取工艺；鉴定了主要产物的化学结构,明确了生物活性及构效关系,考察了药理作用；并利用代谢组学对菌株的整体次级代谢背景进行了全面的轮廓描述。这些研究结果基本阐明了菌株ZG0656的背景知识,明确了其应用前景,为开发具有自主知识产权的天然降糖新药奠定了理论和应用基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章引言

第一节糖尿病与口服降糖药

1.1.1糖尿病

1.1.2口服降糖药

第二节阿卡波糖及其类似物的研究进展

1.2.1阿卡波糖的研究进展

1.2.2阿卡波糖结构类似物的研究进展

第三节天然先导化合物的筛选方法

1.3.1高通量药物筛选

1.3.2多指标筛选

1.3.3高内涵药物筛选

1.3.4高内涵高通量筛选

第四节放线菌资源的研究进展

1.4.1从放线菌开发天然药物的重要性

1.4.2放线菌分类方法学的研究进展

第五节本研究的目的和意义

第二章产生α-淀粉酶抑制剂菌株的高通量筛选

第一节材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

第二节实验结果

2.2.1从土壤样品中分离放线菌

2.2.2 α-淀粉酶／糖苷酶抑制剂的检测体系

2.2.3 α-淀粉酶／糖苷酶抑制剂产生菌的高通量筛选

2.2.4稳定产生α-淀粉酶抑制剂菌株的复筛

第三节讨论与小结

2.3.1菌种库的建立

2.3.2高通量初筛体系

2.3.3复筛体系

小结

第三章菌株ZG0656的菌种鉴定，发酵及其产物获得

第一节材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

第二节实验结果

3.2.1 α-淀粉酶抑制剂生产菌株ZG0656的分类地位

3.2.2 α-淀粉酶抑制剂生产菌株ZG0656的发酵

3.2.3 α-淀粉酶抑制剂AIB656的性质

第三节讨论与小结

3.3.1菌株zG0656的分类地位

3.3.2提高菌株ZG0656的发酵产量

3.3.3优化菌株ZG0656发酵产物的提取工艺

小结

第四章菌株ZG0656发酵产物中化学单体的结构鉴定

第一节材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.1.3化合物结构数据

第二节实验结果

4.2.1化合物1的结构解析

4.2.2化合物2的结构解析

4.2.3化合物3的结构解析

4.2.4化合物4的结构解析

4.2.5化合物5的结构解析

4.2.6化合物6的结构解析

小结

第五章阿卡他定单体对α-淀粉酶活性的抑制

第一节材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

第二节实验结果

5.2.1阿卡他定在酶学水平对α-淀粉酶活性的抑制

5.2.2阿卡他定Ⅱ03和Ⅲ03在离体水平对淀粉水解与葡萄糖吸收的抑制

5.2.3阿卡他定Ⅲ03在体内水平对餐后血糖升高的抑制

第三节讨论与小结

5.3.1各阿卡他定单体与PPA结合的分子机制及抑制机理

5.3.2阿卡他定作为α-淀粉酶抑制剂对糖尿病的疗效

小结

第六章菌株ZG0656的次级代谢物组学

第一节材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2实验方法

第二节实验结果

6.2.1阿卡他定对照品在ESI-MS中的行为

6.2.2阿卡他定对照品在ESI-MS／MS中的行为

6.2.3阿卡他定对照品在UPLCC／ESI-MS／MS中的行为

6.2.4利用UPLC/ESI-MS／MS系统分离并鉴定阿卡他定混合物AIB656中的未知单体

第三节讨论与小结

6.3.1代谢物组学

6.3.2菌株ZG0656次级代谢物的相对丰度

6.3.3菌株ZG0656可能的次级代谢途径

小结

总结与展望

创新点

参考文献

研究成果

致谢