功能性蛋白的特性研究CDK5/p35激酶对肌动蛋白细胞骨架的调控及重组单链胰岛素的折叠特性

摘要

CDKs是一族小分子的丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶，主要功能是调控真核生物各个细胞周期之间的转换。CDK5是CDKs的家族成员，但CDK5不具有调控细胞周期之间转换的功能，在中央神经系统中对一系列细胞过程具有重要的调控作用。因此，CDK5是CDKs家族的特殊成员。CDK5在几乎所有的组织中都有表达，唯独在神经系统中表达量最大、酶活性也最高，完全是因为CDK5的两个神经特异性调节亚基p35和p39的存在。单体的CDK5同其家族的其它成员一样不具有酶活性，只有通过结合其特异性的调节亚基才能激发活性。小鼠基因敲除的实验表明p35是较p39更为重要的调节亚基。在神经细胞中，CDK5/p35激酶对许多重要的细胞过程都具有调控功能，其中包括对肌动蛋白细胞骨架动态活动的调节。
　　 免疫细胞化学实验结果表明CDK5、p35及丝状肌动蛋白共存于延伸中神经突的生长锥部分，并且p35的蛋白类似物p39也与丝状肌动蛋白相互作用。此外，CDK5的几个蛋白底物对肌动蛋白细胞骨架的重构也有一定的影响。这些证据都表明CDK5/p35激酶很可能与肌动蛋白细胞骨架是结合在一起的。然而三者是通过怎样的方式结合在一起以及是否共存在于同一超大蛋白复合体中仍不是很清楚。为此，实验中从鼠脑组织中分离了结合于细胞膜的肌动蛋白细胞骨架组分，并用DNaseⅠ处理此组分，然后用蛋白质杂交技术检测了CDK5、p35及肌动蛋白的分布情况。随着肌动蛋白细胞骨架解聚成单体肌动蛋白，CDK5、p35也随之释放出来，说明在鼠脑组织中CDK5/p35激酶与丝状肌动蛋白是结合在一起的。实验中还优化了从鼠脑组织的膜组分中提取CDK5/p35蛋白复合体的条件，并将提取的组分进行柱层析分析，目的是证明肌动蛋白细胞骨架是否是CDK5/p35超大蛋白复合体的一个组分。柱层析结果表明CDK5、p35及肌动蛋白均在远大于670 kDa的相同组分中出现，说明三者共存于同一超大的蛋白复合体中。丝状肌动蛋白体外共沉淀的实验结果表明p35可以直接结合丝状肌动蛋白，而CDK5则不与丝状肌动蛋白相互作用。这就揭示了在鼠脑组织中三者是以怎样的方式结合并存在于同一超大复合体中的。
　　 p35可直接与丝状肌动蛋白相互作用，接下来将进一步分析p35与单体肌动蛋白的关系。通过单体肌动蛋白的体外结合实验发现p35可通过其N端结构域p10与单体肌动蛋白相互作用。通过肌动蛋白的体外聚合实验发现p35可以促进丝状肌动蛋白在其钩端的聚合，并以依赖于p35及单体肌动蛋白浓度的模式进行。这一典型的肌动蛋白聚合特性与已发现的肌动蛋白核化因子是一致的。p35在COS7细胞内的过量表达可促进蠕虫状丝状肌动蛋白结构的形成，并且p35与丝状肌动蛋白共存于此结构中。这一结果说明了p35在细胞内同样可以促进肌动蛋白的聚合，并与丝状肌动蛋白结合在一起。利用破坏丝状肌动蛋白的药物Cytochalasin B处理表达有p35的COS7细胞，结果导致了上述丝状肌动蛋白结构在胞质内的消失，进一步肯定了p35在细胞内可以聚合丝状肌动蛋白的特性。同时，实验中排除了p35具有切割及延伸效应而导致肌动蛋白聚合的可能性。通过以上的分析最终得出了p35是一个肌动蛋白核化因子的结论。此外，利用荧光及电子显微镜技术观察了由p35聚合而成的丝状肌动蛋白的形态，结果显示p35聚合形成了不分叉的丝状肌动蛋白、p35结合于整根丝状肌动蛋白的侧面，并且绝大多数丝状肌动蛋白呈现束状。此外，P35与丝状肌动蛋白的低速共沉淀实验也进一步证明了p35具有束化丝状肌动蛋白这一功能。P35是GTPase家族成员Rac1的结合蛋白。将P35与Rac1在COS7细胞内共表达，有活性的Rac1可以将p35及肌动蛋白带到细胞周围。这表明p35直接调控肌动蛋白细胞骨架动态活动的功能依赖于Rac1的细胞定位。p35核化及束化丝状肌动蛋白的功能均不需要CDK5的结合，尽管在鼠脑组织中CDK5/p35激酶可直接结合于丝状肌动蛋白。因此，本研究提供了一种全新的p35直接调控肌动蛋白细胞骨架的机制，反映了细胞内CDK5/p35激酶对肌动蛋白细胞骨架的调控是通过多种机制进行的。
　　 此外，本文还对重组单链胰岛素的折叠特性进行了研究。实验中利用蛋白质工程技术制备了三种重组单链胰岛素（PIP）的类似物，[A16Val]PIP、[B17Val]PIP及[B17Asp]PIP，并通过四个参数即蛋白的分泌效率、蛋白质构象、二硫键稳定性及体外折叠效率等来判断进化中保守的A16及B17亮氨酸对重组单链胰岛素序列折叠性的贡献。结果表明A16亮氨酸对重组单链胰岛素序列折叠性的贡献远大于B17亮氨酸，说明A16亮氨酸在胰岛素折叠过程中具有关键性的作用。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

第一节 CDK5及p35的研究背景

1.1.1 CDK5功能的特殊性

1.1.2 p35是CDK5的神经特异性调节亚基

1.1.3 CDK5/p35激酶的调控机制

第二节 细胞骨架蛋白与CDK5/p35激酶的关系

1.2.1 细胞骨架蛋白及其相互作用

1.2.2 细胞骨架蛋白与CDK5/p35激酶的关系

第三节 肌动蛋白核化因子对细胞骨架的动态调节

1.3.1 两种肌动蛋白形式的相互转化

1.3.2 测量肌动蛋白聚合的常用方法

1.3.3 肌动蛋白聚合的三个主要阶段

1.3.4 肌动蛋白核化因子

第四节 重组单链胰岛素折叠的研究背景

第五节 本文的研究目的、意义及实验路线

1.5.1 本文的研究目的

1.5.2 本文的研究意义

1.5.3 本研究的实验设计方案

第二章 CDK5/p35激酶与肌动蛋白细胞骨架结合关系的鉴定

第一节 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

第二节 结果

2.2.1 CDK5/p35激酶结合于去污剂不溶性的肌动蛋白细胞骨架组分

2.2.2 丝状肌动蛋白与CDK5/p35激酶存在于同一超大蛋白复合体

2.2.3 p35直接结合丝状肌动蛋白

第三节 讨论

第四节 小结

第三章 CDK5的神经特异性调节亚基p35核化及束化丝状肌动蛋白功能的研究

第一节 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

第二节 结果

3.2.1 P35与单体肌动蛋白结合关系的鉴定

3.2.2 P35具有聚合肌动蛋白的功能

3.2.3 P35在钩端促进肌动蛋白的聚合

3.2.4 P35是一个新发现的肌动蛋白核化因子

3.2.5 显微镜观察p35聚合形成的丝状肌动蛋白的形态

3.2.6 p35对丝状肌动蛋白解聚的影响

3.2.7 丝状肌动蛋白的低速体外共沉淀实验

3.2.8 P35是丝状肌动蛋白与纤维状微管蛋白的连接蛋白

3.2.9 外源p35存在于肌动蛋白细胞骨架较为活跃的区域

3.2.10 p35调控肌动蛋白的功能依赖于Racl的细胞定位

第三节 讨论

第四节 小结

第四章 保守的A16亮氨酸对胰岛素折叠的贡献

第一节 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

第二节 结果

4.2.1 PIP类似物的表达与纯化

4.2.2 蛋白的分泌效率分析

4.2.3 构象改变分析

4.2.4 二硫键稳定性分析

4.2.5 体外折叠分析

第三节 讨论

第四节 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

附录

个人简历

在学期间发表论文