两个棉花(Gossypium hirsutum)LIM蛋白调控肌动蛋白细胞骨架及其在花药发育中的功能研究

摘要

肌动蛋白(actin)在真核生物的生命活动中占据重要地位，它不仅是构建细胞骨架所必需的物质，而且也参与了真核生物生长发育中的很多过程。一旦肌动蛋白细胞骨架的动力学机制遭到破坏，真核生物的生命活动就会出现不同程度的畸变。在细胞中，一系列的肌动蛋白结合蛋白(ABP)参与了维持肌动蛋白动力学及其功能多样性。
　　LIM蛋白作为一类重要的肌动蛋白结合蛋白，在很多植物中均有报道。它参与调控肌动蛋白丝的装配与解聚过程，包括成核、切割和成帽等。在棉花中，先前有报道指出，该类蛋白参与棉纤维发育调控过程的调控，但对于LIM蛋白在棉花花药发育中的功能研究却鲜有报道。本文对两个在棉花花药中高量表达的LIM蛋白基因(命名为GhPLIM1和GhPLIM2)进行了克隆鉴定，并对其编码蛋白的相关生化功能进行了分析，获得如下研究结果:
　　1、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白的亚细胞定位分析
　　为研究GhPLIM1和GhPLIM2在棉花花药发育中的功能，探究GhPLIM1和GhPLIM2蛋白是否也如其他LIM家族蛋白一样能够与肌动蛋白细胞骨架相互作用，构建了pBI121-GhPLIM1-GFP和pMD-GhPLIM2-GFP融合蛋白表达载体，通过农杆菌LBA4404转化棉花，观察转基因棉花愈伤细胞，均可以观测到GFP荧光。在共聚焦显微镜下观测发现，GhPLIM1-GFP不仅分布在细胞质中，也具有细胞核定位信号。在细胞质中，GhPLIM1-GFP形成一个网络状分布，同时GhPLIM1-GFP荧光信号也在细胞核中有一定的积累。GhPLIM2具有与GhPLIM1类似的亚细胞定位。这说明GhPLIM1和GhPLIM2蛋白都可能是F-actin结合蛋白，且在细胞核中也有分布。
　　2、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白能够与肌动蛋白丝相互作用
　　分别构建pET-28a-GhPLIM1和pET-28a-GhPLIM2原核表达载体，转化大肠杆菌BL21菌株，原核表达纯化GhPLIM1和GhPLIM2蛋白。将表达纯化的LIM蛋白与F-actin进行高速共沉淀实验分析，结果显示GhPLIM1和GhPLIM2蛋白均可与F-actin相互作用，形成相对分子质量较大的复合物，从而能在高速离心力的作用下沉降下来。
　　3、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白能够使肌动蛋白丝成束
　　通过浓缩后的GhPLIM1和GhPLIM2蛋白与F-actin进行低速共沉淀实验分析，结果显示F-actin、GhPLIM1和GhPLIM2均单独存在时，低速离心力均不能使其沉淀下来。而在F-actin中加入GhPLIM1或GhPLIM2蛋白后，F-actin与GhPLIM1或GhPLIM2都可以结合并离心沉降下来。这说明GhPLIM1和GhPLIM2均可以使F-actin成束，使其相对分子质量增加，从而在低速离心力的作用下也能被沉降下来。
　　4、GhPLIM1蛋白能够稳定F-actin细胞骨架
　　将不同浓度的GhPLIM1蛋白与F-actin一起孵育，之后加入LatB(一种F-acin抑制剂，能够使actin丝解聚)，通过高速共沉淀实验使上清和沉淀分离。结果显示，未经过LatB处理时，F-actin绝大部分分布于沉淀中。加入LatB后，部分F-actin被解聚，分布于上清中。之后再加入GhPLIM1蛋白，能够抑制LatB对F-actin的解聚作用，并且随着GhPLIM1蛋白浓度的逐渐升高，其稳定F-actin的作用越明显。
　　5、棉花遗传转化及转基因棉花植株的鉴定
　　除上述两个LIM家族基因外，本文也对棉花GhWLIM5基因进行了研究。分别构建了pBI-35S-GhWLIM5RNAi、pBI-pTua9-GhWLIM5RNAi和pBI-pTua9-GhWLIM5OE（过量表达）载体，通过农杆菌LBA4404介导的棉花转化，获得大量转基因棉花植株（T0代）。目前，已收获到一些转基因植株的T1代种子，进一步的分析鉴定正在进行中。

目录

声明

摘要

一、引言

1．1 LIM蛋白的发现及其结构特征

1．2 动物LIM蛋白分类及其功能研究

1．2．1 LIM同源结构域蛋白(LIM-HD)

1．2．2 LIM-only(LMO)蛋白

1．2．3 LIM激酶蛋白(LIMK)

1．2．4 其他LIM蛋白

1．3 植物LIM蛋白分类及其功能研究

1．4 植物中肌动蛋白成束蛋白的研究进展

1．4．1 肌动蛋白成束蛋白在植物细胞中的分布情况

1．4．2 肌动蛋白成束蛋白在细胞中的功能研究

1．5 研究目的和意义

二、材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种和载体质粒

2．1．3 所用工具酶和各种试剂盒

2．1．4 培养基及相关试剂

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 裂殖酵母的形态观察

2．2．2 棉花愈伤细胞GFP荧光的观察

2．2．3 蛋白的原核表达、纯化及高速低速共沉淀

2．2．4 烟草转化

2．2．5 CTAB法小量提取棉花gDNA

2．2．6 CTAB-PVP法提取棉花纤维RNA

2．2．7 Trizol Reagent RNA法提取烟草RNA

三、实验结果

3．1 ChPLIM1与GhPLIM2基因及其编码蛋白的结构分析

3．1．1 GhPLIM1和GhPLIM2蛋白的疏水性分析

3．1．2 GhPLIM1／2蛋白与其他棉花LIM蛋白的进化关系分析

3．2 GhPLIM1和GhPLIM2蛋白亚细胞定位

3．3 GhPLIM1和GhPLIM2的转基因裂殖酵母形态观察

3．3．1 pREP-5N-GhPLIM1／2表达载体的构建

3．3．2 转基因裂殖酵母的表型无明显变化

3．4 GhPLIM1和GhPLIM2蛋白相关生化试验

3．4．1 GhPLIM1蛋白与GhPLIM2蛋白原核表达载体的构建

3．4．2 GhPLIM1蛋白的原核表达

3．4．3 GhPLIM1蛋白的大量纯化

3．4．4 诱导表达GhPLIM2蛋白

3．4．5 GhPLIM2蛋白的纯化浓缩

3．4．6 GhPLIM1与GhPLIM2蛋白均可以体外结合F-actin

3．4．7 GhPLIM1和GhPLIM2蛋白能促进肌动蛋白丝成束

3．4．8 GhPLIM1能稳定F-actin的解聚

3．5 GhPLIM2转基因烟草初步分析

3．6 GhWLIM5转基因棉花初步分析

3．6．1 T0代转基因棉花的鉴定

3．6．2 pBI-pTua9-GhWLIM5 RNAi转基因棉花T0代表型初步分析

3．6．3 T1代pBI-pTua9-GhWLIM5 RNAi转基因棉花的鉴定

四、讨论

4．1 GhPLIM1／2的蛋白结构分析

4．2 GhPLIM1／2可能调控花粉管的生长发育过程

4．3 GhPLIM1／2的亚细胞定位分析

参考文献

硕士期间参与发表论文

附录 本文缩写符号

致谢