14-3-3蛋白参与BR信号调控及其在棉花(Gossypium hirsutum)纤维发育中的功能研究

摘要

棉花是我国重要的经济作物，是关系国计民生的重要物资。随着工业发展和人民生活水平的提高，人们对高质量纺织品的需求量逐步增大，因而纺织工业对棉纤维品质的要求更高。棉花纤维是由胚珠表皮分化而来的不分枝的单细胞毛状突起，其突起细胞数目及纤维长度等指标直接与棉花产量和品质相关。研究棉纤维分化和发育的分子机制，克隆棉纤维发育相关基因，对于棉纤维品质改良具有重要意义。
　　油菜素内酯(BR）是一种重要的植物激素，对棉纤维细胞起始分化和伸长生长都有重要作用。为探讨影响棉花纤维发育的BR信号通路，本文研究了Gh14-3-3与BZR1等靶蛋白的相互作用及BR信号在棉纤维发育中的调控作用，取得如下主要研究结果:
　　1.Gh14-3-3h基因克隆鉴定及表达分析本实验室在先前的研究中分离鉴定了7个棉花14-3-3基因。在此基础上，利用酵母双杂交技术，从棉花纤维cDNA酵母双杂交文库中筛选到一个新的14-3-3蛋白，命名为Gh14-3-3h。利用PCR扩增技术，克隆了该蛋白基因的DNA全长序列和cDNA序列。序列分析表明，Gh14-3-3h基因含有6个外显子和5个内含子，属于ε型。Gh14-3-3h蛋白与其它物种的14-3-3蛋白氨基酸同源性达到61％-92％，具有14-3-3蛋白典型的结构特征，具有九个保守的α螺旋结构，但其N端和C端都不保守。
　　利用荧光定量PCR技术分析了Gh14-3-3h在棉花组织中的表达谱。结果表明，Gh14-3-3h基因在纤维中优势表达，而在其它组织中表达量较低。在棉纤维发育过程中，Gh14-3-3h基因在棉纤维发育早期(3-10 DPA)表达量较高，而在纤维细胞次生壁发育时期表达量逐步下降。并且，在胚珠离体培养的条件下，用2，4-表油菜素内酯(BL)处理棉花10天纤维，发现Gh14-3-3h表达量显著上调。这说明Gh14-3-3h在棉纤维细胞起始和伸长过程中发挥一定的调控作用，而且可能涉及到棉纤维发育中的BR信号应答。
　　2.Gh14-3-3互作蛋白筛选及蛋白质相互作用验证为了研究Gh14-3-3在棉花纤维发育中涉及的调控信号通路，利用酵母双杂交系统，以Gh14-3-3f/g/h为诱饵蛋白，筛选棉花纤维cDNA酵母双杂交文库，获得了32种蛋白。它们可分为6大类，分别是14-3-3蛋白、BR等激素相关蛋白、代谢相关蛋白、信号相关蛋白、生长发育相关蛋白及功能未知蛋白。将这些蛋白序列在棉花EST公共数据库中进行比对分析，发现这些互作蛋白都能在棉纤维EST库中找到其同源序列，说明Gh14-3-3蛋白可能与这些蛋白在棉花纤维细胞中发生相互作用，共同调节棉纤维生长发育。
　　14-3-3蛋白是一类高度保守的小分子调节蛋白，通常以同源或异源二聚体形式存在。在筛选的棉花14-3-3互作蛋白中，有大约2.8％是14-3-3蛋白本身，这表明14-3-3蛋白确实能够形成同源或异源二聚体。因此，我们进一步验证了Gh14-3-3h蛋白与其它5个Gh14-3-3蛋白之间的相互作用。结果表明，Gh14-3-3h能够与其它Gh14-3-3蛋白特异性相互作用，形成异源二聚体。因此，我们推测这些14-3-3蛋白可能以二聚体的形式参与棉花纤维细胞发育的调节。
　　3.GhBZR1与Gh14-3-3蛋白相互作用分析在上述所筛选鉴定的棉花14-3-3互作蛋白中，有一个与拟南芥BZR1具有较高同源性的蛋白，命名为GhBZR1。对棉花BZR1蛋白序列进行分析，发现有22个可能被BIN2磷酸化的位点，并且有PEST区域和可能与14-3-3相互作用的作用位点。而且，蛋白质亚细胞定位分析表明，GhBZR1分布在细胞质和细胞核中，但受BL诱导后，该蛋白能够在细胞核中大量积累。为研究磷酸化对BZR1与14-3-3相互作用的影响，我们克隆了棉花BIN2蛋白基因。该基因表达与GhBZR1表达有其时空的一致性，都在棉花纤维伸长期优势表达。酵母双杂交和pull down实验证明GhBIN2与GhBZR1能够发生相互作用。在体外磷酸化实验中，GhBIN2能够磷酸化GhBZR1。而且，被磷酸化的GhBZR1能够与Gh14-3-3相互作用。进一步实验证明，GhBZR1与Gh14-3-3蛋白相互作用是通过保守的ModeⅠ基序来完成的，其中第163位磷酸化的丝氨酸(Ser)是二者相互作用的关键位点。这表明被GhBIN2磷酸化的GhBZR1与Gh14-3-3相互作用可能对棉纤维细胞伸长发育发挥重要调控作用。
　　4.GhMYB73与14-3-3蛋白相互作用分析在上述所筛选鉴定的棉花14-3-3互作蛋白中，有一个与拟南芥MYB73具有较高同源性的蛋白，命名为GhMYB73。它在棉花纤维伸长期表达量最高，定位在细胞核中，表明该蛋白可能是一个MYB转录因子。实验表明，GhMYB73可以与拟南芥BR通路中关键转录因子AtBES1在酵母系统中相互作用，推测GhMYB73可能参与BR信号通路。而且，酵母双杂交和pull down实验表明，GhBIN2也能够与GhMYB73蛋白发生相互作用，并在体外磷酸化GhMYB73，而磷酸化的GhMYB73与Gh14-3-3蛋白发生相互作用。这表明GhMYB73可能参与了14-3-3调节的BR信号通路，在棉纤维发育过程中发挥作用。
　　5.Gh14-3-3蛋白在棉纤维细胞发育中的功能分析为研究14-3-3蛋白在棉纤维细胞分化和发育中的调节作用，构建了Gh14-3-3L/e/h等3个基因的RNA干扰(RNAi)表达载体和Gh14-3-3L过量表达载体，转化棉花，获得转基因棉花植株(T0代)及其后代株系(T1-T4代)。对转基因棉花后代株系(T1-T4代)表型观察和遗传分析表明，在RNAi转基因棉花中，纤维细胞起始和伸长发育都受到抑制，导致纤维细胞数目减少，长度变短。Gh14-3-3L/e/h RNAi转基因棉花成熟纤维长度仍然短于野生型，而过量表达Gh14-3-3L棉纤维长度则较野生型长，这表明Gh14-3-3蛋白在棉纤维伸长发育中发挥重要作用。离体胚珠培养实验表明，与野生型相比，Gh14-3-3LRNAi转基因棉花纤维长度和TFU均减少，而过量表达Gh14-3-3L转基因棉花纤维长度和TFU均有所增加。当施加外源BL时，Gh14-3-3LRNAi转基因棉花纤维长度和TFU与未加BL相比虽有所增加，但仍没有恢复到野生型的相当水平。在不添加外源BL的情况下，与野生型相比，Gh14-3-3L RNAi棉花纤维中GhCPD和GhDWF4基因表达显著下降，而在过量表达Gh14-3-3L转基因棉花纤维中GhCPD表达量没有发生改变，GhDWF4表达量则上调。在添加BL后，Gh14-3-3L RNAi棉花纤维中只有GhDWF4表达水平轻微下调。当BL施加后，与野生型相比，两个BR合成相关基因在过量表达Gh14-3-3L棉花纤维中表达量迅速下调。以上结果表明，在棉花纤维伸长阶段，Gh14-3-3可能对BR信号中的反馈调节起着一定的调控作用，从而影响棉花纤维伸长生长和TFU产量。
　　为研究Gh14-3-3 L/e/h RNAi和过量表达棉纤维发育与BR信号调控的关系，检测了一些BR信号通路及纤维发育相关基因在转基因棉花纤维中的表达变化情况。结果表明，GhBZR1、GhXTH1、GhEXP、G厅TUB1和GhCesA5在Gh14-3-3L/e/h RNAi转基因棉花纤维中和Gh14-3-3L过量表达棉花纤维中表达都有不同程度的变化。多代(T1-T4)遗传分析表明，这些基因在不同世代的转基因棉花中的表达都发生改变，具有遗传稳定性。以上结果表明Gh14-3-3蛋白参与调节BR信号通路，通过改变BR信号相关基因的表达水平来影响棉花纤维起始和伸长发育过程。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 14-3-3简介

1．1．1 14-3-3的发现和命名

1．1．2 14-3-3的结构

1．1．3 14-3-3的分类

1．1．4 14-3-3的作用

1．1．5 14-3-3参与植物生长发育

1．2 BR的研究进展

1．2．1 油菜素内酯的发现

1．2．2 油菜素内酯的生理作用

1．2．3 BR信号通路的相关研究

1．3 棉花纤维的发育

1．3．1 棉纤维的发育过程

1．3．2 BR影响棉花纤维的发育

1．4 立题依据和研究意义

第二章 Gh14-3-3基因的克隆鉴定及表达分析

2．1 实验材料

2．1．1 棉花材料

2．1．2 棉花Gh14-3-3基因的获得

2．1．3 菌株和质粒

2．1．4 工具酶及试剂盒

2．1．5 常用缓冲液和储存液

2．1．6 常用培养基

2．1．7 提取棉花各组织RNA的试剂及实验用品的处理

2．1．8 转化棉花常用培养基

2．2 实验方法

2．2．1 Gh14-3-3s cDNA和蛋白质序列分析

2．2．2 棉花各组织材料的收取

2．2．3 棉花纤维材料的离体胚培养和激素处理

2．2．4 棉花基因组DNA的提取

2．2．5 棉花各组织RNA的提取

2．2．6 实时定量RT-PCR

2．2．7 棉花Gh14-3-3h全长序列的克隆

2．3 结果

2．3．1 Gh14-3-3h的分离鉴定

2．3．2 Gh14-3-3h与其它棉花14-3-3的蛋白比对

2．3．3 Gh14-3-3h与其它14-3-3的进化树分析

2．3．4 Gh14-3-3h基因的全长的克隆鉴定

2．3．5 Gh14-3-3h在棉花各组织及纤维发育时期的表达

2．3．6 Gh14-3-3h在徐州142和无绒无絮棉纤维中的表达

2．3．7 Gh14-3-3h表达受BL的诱导

2．3．8 Ghl4-3-3h蛋白的亚细胞定位

2．4 讨论

第三章 Gh14-3-3互作蛋白的筛选及相互作用验证

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 质粒

3．1．3 棉花纤维酵母双杂交cDNA文库

3．1．4 工具酶及试剂盒

3．1．5 常用缓冲液

3．1．6 常用培养基

3．2 实验方法

3．2．1 构建诱饵质粒

3．2．2 pGBKT7-Gh14-3-3重组质粒转化酵母细胞

3．2．3 诱饵蛋白自激活检测

3．2．4 诱饵蛋白毒性检测

3．2．5 酵母细胞接合筛选互作蛋白

3．2．6 鉴定阳性克隆

3．2．7 互作蛋白的分析

3．3 结果

3．3．1 pGBKT7-Gh14-3-3载体的构建

3．3．2 诱饵质粒转化酵母及其蛋白自激活检测结果

3．3．3 诱饵蛋白的毒性检测

3．3．4 Gh14-3-3f／g／h的互作蛋白筛选鉴定

3．3．5 筛选得到的阳性克隆回转验证

3．3．6 筛选得到的互作蛋白序列测定及分析

3．3．7 Gh14-3-3h与其它5个Gh14-3-3蛋白间的相互作用

3．3．8 互作蛋白选择性的与Gh14-3-3蛋白相互作用

3．3．9 Gh14-3-3h通过保守的lys位点与靶蛋白相互作用

3．4 讨论

第四章 GhBZR1的分离鉴定及其蛋白质相互作用分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料和菌株

4．1．2 其它材料

4．1．3 常用试剂和工具酶

4．1．4 常用缓冲液

4．1．5 常用培养基

4．1．6 原核表达蛋白及蛋白纯化所用试剂及缓冲液

4．1．7 蛋白电泳所需试剂及缓冲液

4．1．8 Western-blot所用试剂和缓冲液

4．2 实验方法

4．2．1 GhBZR1和GhBIN2基因RT-PCR引物序列

4．2．2 GhBZR1和GhBZR1PL过量表达拟南芥

4．2．3 GhBZR1：eGFP在烟草叶肉细胞中的表达

4．2．4 酵母双杂交验证GhBZR1和GhBIN2的相互作用

4．2．5 原核表达和纯化蛋白

4．2．6 GhBZR1抗体的制备

4．2．7 Western-blot分析

4．2．8 His-GhBIN2体外磷酸化MBP-GhBZR1蛋白

4．2．9 pull-down实验验证体外磷酸化的GhBZR1与Gh14-3-3的相互作用

4．2．10 双分子荧光互补实验验证GhBZR1和Gh14-3-3L的相互作用

4．3 结果

4．3．1 GhBZR1的分离及进化系统分析

4．3．2 BL影响GhBZR1蛋白亚细胞定位

4．3．3 GhBZR1蛋白的纯化及抗体的制备

4．3．4 GhBZR1与GhBIN2蛋白间的相互作用

4．3．5 GhBZR1与Gh14-3-3蛋白的相互作用

4．3．6 在拟南芥中过量表达GhBZR1的表型分析

4．4 讨论

第五章 GhMYB73克隆鉴定及其蛋白质相互作用分析

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料和菌株

5．1．2 其它材料

5．1．3 工具酶

5．1．4 常用缓冲液

5．1．5 常用培养基

5．1．6 原核表达蛋白及蛋白纯化所用试剂及缓冲液

5．1．7 蛋白电泳所需试剂及缓冲液

5．1．8 Western-blot所用试剂和缓冲液

5．2 实验方法

5．2．1 原核蛋白表达，纯化和western-blot

5．2．2 His-GhBIN2体外磷酸化GST-GhMYB73蛋白

5．2．3 pull-down实验验证体外磷酸化的GhMYB73与Gh14-3-3的相互作用

5．3 结果

5．3．1 GhMYB73基因的克隆和其进化树分析

5．3．2 GhMYB73组织表达情况

5．3．3 BL诱导GhMYB73的表达

5．3．4 GhMYB73的亚细胞定位

5．3．5 GhMYB73与AtBES1的相互作用

5．3．6 GhMYB73与GhBIN2的相互作用

5．3．7 GhBIN2磷酸化GhMYB促进其与Gh14-3-3e的相互作用

5．3．8 GhMYB73过量表达拟南芥mRNA水平上的鉴定

5．3．9 GhMYB73过量表达拟南芥表型的初步分析

5．4 讨论

第六章 Gh14-3-3蛋白在棉花纤维发育中的功能研究

6．1实验材料

6．1．1 植物材料

6．1．2 菌株

6．1．3 工具酶及试剂盒

6．1．4 常用缓冲液及储存液

6．1．5 常用培养基

6．1．6 转化棉花常用培养基

6．2 实验方法

6．2．1 引物设计

6．2．2 拟南芥转化

6．2．3 拟南芥基因组DNA提取

6．2．4 拟南芥RNA提取，纯化及反转录

6．2．5 转化棉花外植体

6．2．6 棉花基因组DNA的提取

6．3 结果

6．3．1 Gh14-3-3h过量表达拟南芥mRNA水平检测

6．3．2 Gh14-3-3h过量表达拟南芥表型分析

6．3．3 Gh1-3-3h过量表达拟南芥标记基因的表达分析

6．3．4 Gh14-3-3h RNAi载体转化棉花

6．3．5 Gh14-3-3s转基因棉花的分析

6．4 讨论

结论

本论文的主要创新点

参考文献

附录

博士期间撰写和发表的学术论文

致谢