核糖体延伸因子LepA的GTP酶活性的突变分析

摘要

LepA是一种新报道的核糖体延伸因子,它在核糖体蛋白合成过程中起着重要的作用。LepA蛋白的结构和翻译因子如EF-G具有很高的结构相似性,都具有GTP酶活性。为了探究LepA的GTP酶水解机理,完善对GTP酶超家族水解的认识,我们设计了本文的实验。我们通过megaprimer PCR的方法构建了四个Lep A突变体,即T19A,R50A,N131A及S162A。这四个突变点都位于LepA蛋白I结构域的GTP结合中心附近,可能参与GTP的水解过程。我们对这几个位点做的是负性突变。然后把含有LepA突变基因的质粒转入大肠杆菌细胞内,进行IPTG诱导表达。利用纯化的LepA蛋白,测定这几个突变蛋白以及野生型LepA蛋白的酶动力学参数。实验结果显示,虽然这几个突变蛋白和野生型LepA蛋白的酶活性有所不同,但是,突变蛋白都具有明显的GTP酶活性。本文的实验结果表明,这几个位点对于LepA.的GTP水解过程不是必需的。

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论文说明：英文缩略语表

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第一章 引言

1.1 中心法则介绍

1.2核糖体组成与分布：

1.3 蛋白质合成过程

1.3.1 起始

1.3.2延伸循环

1.3.3终止

1.4 GTPase概述

1.5延伸因子LepA

1.5.1 LepA的发现和结构

1.5.2 LepA与EFG的比较

1.5.3 LepA功能的探索

第二章实验部分

2.1 实验的设计思想

2.2 实验流程图

2.3 实验材料

2.4 实验方法

2.4.1寡核苷酸序列的合成

2.4.2质粒pET-21b的提取及纯化

2.4.3 megaprimer PCR定点突变

2.4.4双酶切反应及纯化

2.4.5连接反应

2.4.6重组质粒转化

2.4.7重组质粒初步筛选

2.4.8重组质粒的序列测定

2.4.9融合蛋白质的表达和纯化

2.4.10[γ-32 P]GTP的纯化

2.4.11核糖体的提取

2.4.12突变的LepA酶特征常数的测定

第三章实验结果与讨论

3.1 pET-21b-LepA质粒的构建

3.2 LepA的突变体的验证

3.2.1 PCR验证

3.2.2规模表达验证

3.2.3测序验证

3.3 LepA及其突变体的GTP酶活性的测定

结 论

参考文献

致谢

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