肺炎链球菌35A NDP-D-mannitol合成途径中mnp1和mnp2的克隆与表达

摘要

荚膜（capsule）为包裹在单个细菌细胞上，在细胞壁上有固定一层厚度不定的胶状物质。其主要成分为多糖，多肽或蛋白质，尤以多糖居多。荚膜多糖的表达是细菌在血液中的存活及其毒力大小的关键，同时它也是宿主抗体的目标以及制备有效抗原的基础。具有荚膜的细菌能表达许多不同的荚膜多糖，表现出抗原的高度变化性，肺炎链球菌的高度致病性是由于其荚膜多糖的多样性造成的。因此，研究荚膜多糖的合成机制，可以了解相关细菌的致病原因，为相关药物的制备提供依据，从而有效阻止细菌的感染。
　　 在肺炎链球菌荚膜多糖中已发现的18种单糖及其衍生物中，mannitol-6-p是3种尚未确定合成途径的罕见单糖之一。明确其合成途径，不仅有助于我们了解荚膜多糖的形成机制，也为实现生物学方法体外合成该糖奠定基础。
　　 根据已测得的Sp.35A荚膜多糖结构以及荚膜多糖基因簇序列，David M.Aanensen等人预测合成罕见单糖mannitol-6-p由mnp1和mnp2基因编码蛋白完成。我们利用生物信息学的手段进一步预测了mannitol合成的具体路线。
　　 本文的工作是首先利用pET表达系统在E.coli BL21（DE3）中表达mnp1和mnp2基因编码的蛋白，并优化了最适的表达条件，同时对这两个蛋白进行了纯化。纯化后的蛋白可以进一步应用于酶促反应，从而对这些蛋白进行功能鉴定。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前 言

1.1 研究背景

1.1.1 肺炎链球菌

1.1.2 荚膜多糖

1.1.3 肺炎链球菌的荚膜多糖

1.1.4 罕见单糖合成基因的研究进展

1.1.5 肺炎链球菌35A的荚膜多糖

1.2 蛋白质的重组表达与纯化策略

1.2.1 重组蛋白的表达

1.2.2 蛋白的纯化

1.3 研究目标、内容和创新性

1.3.1 研究目标

1.3.2 研究内容

1.3.3 本项工作的创新性

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 主要试剂

2.1.4 培养基及试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 生物信息学分析

2.2.2 菌株Sp 35A（G1521）基因组DNA的小量提取方法

2.2.3 聚合酶链式反应（PCR）

2.2.4 质粒构建方法

2.2.5 感受态细胞的制备和转化

2.2.6 重组蛋白在E.coli BL21（DE3）中的小量表达方法

2.2.7重组蛋白在E.coli BL21（DE3）中的大量表达及纯化

2.2.8 蛋白含量的测定方法

2.2.9蛋白大小的估算方法

第三章 结果与分析

3.1 肺炎链球菌35A（G1521）荚膜多糖基因簇中mnp1与mnp2基因的序列分析及合成途径预测

3.2 pET-28a（+）重组质粒的构建

3.2.1 扩增目的基因mup1,mnp2

3.2.2 pET-28a（+）及mnp1,mnp2双酶切

3.2.3 筛选重组质粒

3.3 Mnp1,Mnp2蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达和纯化

3.3.1 Mnp1,Mnp2在E.coli BL21（DE3）中的表达

3.3.2 Mnp1,Mnp2蛋白的纯化

3.4 Mnp1,Mnp2蛋白浓度的测定

3.4.1 标准法制定标准曲线

3.4.2 纯化后蛋白的浓度的测定

3.5 Mnp1和Mnp2蛋白分子量估算

第四章 讨论

4.1 Sp.35A中的罕见单糖合成基因mnp1和mnp2

4.2 温度、IPTG和时间对Mnp1,Mnp2表达的影响

第五章 结论

参考文献

致 谢

个人简历