海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径相关延长酶的克隆与表达

摘要

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,简称DHA)是目前发现的碳链最长、不饱和度最高的ω-3长链高度不饱和脂肪酸,具有抗心血管疾病、抗血脂、降血压、预防各种癌症等重要生理功能,是目前研究的热点.DHA的生物合成途径涉及到脂肪酸碳链的延长反应,催化这一反应的酶是碳链延长酶.由于碳链延长酶是膜结合蛋白,目前还没有行之有效生化手段对其进行分离纯化进行研究,因此只能通过基因的克隆,从分子水平对其酶学表征进行研究.本文以海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,利用RT-PCR结合RACE,获得了两个碳链延长酶的完整基因,并在S.cerevisiae INVSc1中实现功能的表达.延长酶TFD6基因全长816 bp(GenBankID:DQ299828),编码271个氨基酸,预测的延长酶分子量为31.3 Kda,等电点为9.26,是个疏水性很强的蛋白,具有5个跨膜区;延长酶TFD5基因全长831 bp(GenBank ID:DQ299827),编码276个氨基酸,预测的延长酶分子量为31.9 Kda,等电点为8.8,也是个疏水性很强的蛋白,具有7个跨膜区.TFD6、TFD5延长酶都具有一个HXXHH组氨酸高度保守序列与KKXX内质网结合信号肽.利用隐马尔夫模型结合Rosetta模拟程序,对TFD6、TFD5延长酶三级结构进行研究,结果表明延长酶跨膜区的主要结构是β-片层结构与无规则卷曲.HXXHH保守序列主要位于无规则卷曲中.聚类以及进化树分析表明Thraustochytrium sp.FJN-10延长酶与其它物种的延长酶同源性较低,TFD6与Thraustochytrium △6延长酶进化距离最近,TFD5与Thraustochytrium sp.△5延长酶进化距离最近.构建了Thraustochytrium sp.FJN-10 TFD6、TFD5延长酶酵母表达系统,脂肪酸甲酯的气相色谱分析表明,TFD6可延长C18:3n-6至C20:3n-6,TFD5可延长C20:5n-3至C22:5n-3.延长酶的表达成功,为基因工程技术生产DHA以及其它高度不饱和脂肪酸奠定基础.