Nisin高产菌株Lactococcus lactis N420的基因工程构建及其发酵工艺的优化

摘要

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）能够产生多种对人有利的细菌素。乳酸链球菌素（乳链菌素，Nisin）是由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）产生的一种羊毛硫细菌素（Lantibiotics），它可以通过在细胞膜上形成孔道，促使细胞内容物渗漏引起细胞凋亡来抑制细菌的生长。由于它的抑菌作用以及进入人体后能够被迅速酶解成为对人体无害的物质，因此是一种高效、天然、绿色的防腐剂。
　　 对于Nisin的理化性质以及生物合成基因已有广泛研究，但在二组分调节机制外是否还存在其他调控基因仍有待研究。此外，随着国际社会对Nisin需求量的增大，传统的诱变育种已经不能够满足日益增加产量的需求。本文通过Mu转座技术对影响Nisin效价的基因进行研究，在确定基因功能的基础上，构建基因工程高产菌株并进行发酵生产工艺的优化，进而达到高产的目的。
　　 本文首次利用人工Mu转座技术对一株NisinZ生产菌株Lactococcus lactisN302中影响其效价的基因展开了研究。首先利用Mu转座插入技术建立菌株的突变子文库，然后从约1000个转化子中筛选出一株效价明显增大的转化子Lactococcus lactis N420进行基因克隆。挑取阳性克隆进行测序，确定了Mu转座片段插入位点。结果表明菌株Lactococcus lactis N420效价增大是由于Mu转座子单拷贝插入基因choQ造成，已有研究表明choQ基因编码胆碱ABC复合体ATP结合蛋白，具有渗透调节和毒性调节的功能。本研究首次发现它可能在Nisin生物合成中具有调节作用。
　　 针对Nisin高产突变株Lactococcus lactis N420进行了发酵工艺优化。首先采用单因素实验及正交实验等确定菌株发酵所需要的最佳营养物质是酵母粉、复合氮源、蔗糖和K2HPO4·3H2O，然后采用响应面分析法确定营养物质的最优配比。结果表明菌株Lactococcus lactis N420的最优培养基成分为（w/v）：酵母粉1.50％，复合氮源2.15％，蔗糖3.79％，K2HPO4·3H2O1.00％。最后经小试（10L）发酵实验，产量为9233 IU/mL。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

第一节 Nisin的理化性质、生物合成及其应用

1.1.1 Nisin的理化性质

1.1.2 Nisin生物合成的相关基因及其调控机制

1.1.3 Nisin的作用机制

1.1.4 Nisin的应用

第二节 Nisin诱导的基因表达系统（NICE）的特点及其应用

1.2.1 Nisin诱导的基因表达系统（NICE）

1.2.2 NICE系统在Nisin生物检测中的应用

1.2.3 NICE系统的其它应用

第三节 Nisin高产菌株的筛选及生产工艺的研究现状

1.3.1 生产用菌种的筛选与改造

1.3.2 发酵条件的优化

第四节 本文的研究意义、目的以及实验路线

1.4.1 研究意义和目的

1.4.2 实验路线

第二章 Nisin生产菌株突变子库的构建及高产菌株的筛选

第一节 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

第二节 结果与讨论

2.2.1 Nisin效价增大突变子的筛选与鉴定

2.2.2 Mu转座突变子的PCR检测

2.2.3 人工Mu转座子插入位点侧翼基因的克隆

2.2.4 Mu转座子DNA插入位点的遗传位置定位

2.2.5 Mu转座子插入位点基因功能的分析

第三节 本章小结

第三章 Nisin高产菌株Lactococcus lactis N420发酵工艺研究

第一节 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

第二节 结果与讨论

3.2.1 L.lactis 菌株发酵生长曲线和效价曲线的测定

3.2.2 L.lactis N420培养基的初步优化

3.2.3 L.lactis N420培养基的响应面优化

3.2.4 L.lactis N420发酵小试（10 L）实验

第三节 本章小节

3.3.1 几个重要条件的确定

3.3.2 L.lactis N420发酵工艺优化结果

3.3.3 L.lactis N420发酵小试实验结果

第四章 结论与展望

第一节 结论

第二节 展望

参考文献

致谢

附录

附录A 质粒图谱

附录B DNA分子量标准Marker

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果