用于清除尿素延缓慢性肾衰的基因工程乳酸菌研究

摘要

肾衰竭是一种发病率很高的常见疾病。目前的治疗方法包括血液透析和血液滤过有显著疗效，但是只有少数患者能够承担这两种治疗。为了开发出一种具有临床应用潜力，无毒副作用，可用于治疗慢性肾衰竭的口服剂——工程菌疗法，本研究将安全、益生的乳酸乳球菌Lactococcus Lactis subspMG1363作为工程化研究对象，通过外源脲酶基因修饰及驯化的手段，降解肠道中积累的多余的尿素。
　　 外源脲酶基因修饰Lactococcus Lactis subspMG1363是将Klebsiellaaerogenes中的脲酶基因片段克隆入pMG36e，构建重组质粒pMG36eure，并转化入L.Lactis MG1363，筛选鉴定。通过RT-PCR，Western-blotting，从转录和表达水平鉴定其表达。测定了脲酶基因修饰的E.ColiDH5α和L.Lactis MG1363降解尿素的能力。培养工程化的E.Coli DH5α12～16小时，可将尿素的浓度从30mg/dL下降到12 mg/dL，下降57％；工程化的乳酸菌脲酶活性是pH和金属Ni离子依赖的，在pH=6.5～7.5，Ni离子大于200μM时，培养脲酶基因修饰的乳酸菌19～24h，培养基尿素浓度从起始的32.61mg/dL下降到18.59 mg/dL，下降了43%。
　　 通过驯化方法逐渐增加培养基中的尿素浓度，减少其他氮源，传代培养获得以尿素为唯一氮源的乳酸菌，使Lactococcus Lactis subspMG1363能够在富含尿素的培养基中生长，使乳酸菌获得在体外消耗和分解尿素的能力。获得的驯化菌通过生理生化和16S RNA鉴定，确定菌株没有被污染的情况下，可以在24小时内，将培养基中的尿素浓度从40.01±1.94 mg/dL显著降低到32.99±3.13mg/dL（清除率l7.5%）这些数据表明Lactococus lactis通过驯化获得了分解尿素的能力，用NaHCO3缓冲乳酸菌培养过程中造成的pH的降低，添加200μM的Ni离子，优化工程菌降解尿素的能力，24小时的培养可以使培养基中的尿素浓度从40.09±0.76 mg/dL显著降低到25.73±2.46 mg/dL（清除率35.8%）。
　　 对两种途径得到的工程菌在模拟胃肠环境中进行了研究，包括低pH(pH2.5～4.0)，含胆酸钠盐（浓度0.1%），对肠道中的微生物（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）以及抗生素的耐受性等。结果表明工程菌可以在酸性pH的条件下生存两小时以上；继而在O.1%高胆酸盐浓度中生存6小时以上，并保持分解尿素的能力；在模拟胃肠环境下脲酶基因修饰的Lactococcus Lactis subspMG1363培养10 h，尿素的清除率为30%；24 h后，清除率为65%；而驯化菌在模拟胃肠环境下，6个小时内将培养基中的尿素从40.71±0.34 mg/dL降低到36.61±5.17 mg/dL，清除率10.1%。
　　 研究还发现乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有拮抗作用；对临床常见的抗生素氨苄青霉素、四环素、庆大霉素、罗红霉素和头孢拉定都具有明显的抗生素抗性。适合作为生化制剂的优良菌种。
　　 口服食品级工程菌降解尿素水平有可能成为治疗慢性肾衰的一种新方法。为了评价工程菌的有效性和安全性，将工程菌及普通乳酸菌分别灌胃wistar大鼠（1个月），观察动物的一般状况，包括进水进食，体重，血液生化，血常规指标等，并与正常大鼠进行比较．结果显示，试验组大鼠与正常进食的大鼠在以上观察的指标方面无显著差异．说明工程乳酸菌是安全的。为了研究工程菌在体内降低尿素水平和延缓慢性肾衰的能力，通过肾动脉结扎建立肾衰模型大鼠，分别灌胃工程菌和普通乳酸菌（1个月），记录模型鼠的死亡率，检测血尿、血肌酐、尿蛋白等指标．结果发现，服用工程菌的大鼠症状和检测指标都优于对照组，说明了工程菌的有效性．