基于聚乙烯亚胺的聚阳离子基因载体的合成及应用

摘要

载体以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性等问题一直是基因治疗领域的关键问题。高分子基因传递系统在过去十几年取得明显进展，结果表明结构简单的高分子很难帮助DNA穿越体内及细胞内的所有屏障，针对具体的应用目的，设计多组分、多功能载体将是未来几年高分子基因治疗研究的方向。其中聚乙烯亚胺是一类转染效率高应用最广泛的高分子类基因转染试剂。经过很多研究证明，聚乙烯亚胺的转染效率随着分子量的增高而增大。一般来说，高分子量的PEI(25kDa)具有很高的毒性并且不能降解.相反低分子量的PEI(LMWPEI，<2KDa)几乎没有毒性但是也没有基因转染效率。考虑到低分子量的PEI的无毒性，本文研究内容集中在对小分子量PEI的修饰上，并对其进行生物性能上的评价。本研究分为三个部分：
　　 第一部分为阳离子多肽型基因载体的合成，主要是通过将低分子量的聚乙烯亚胺(PEI800)与聚(L-天冬酰胺-co-L-赖氨酸)PSL进行开环反应合成了一类新型的基因载体，研究了这类载体与DNA形成复合物的性质以及介导绿色荧光蛋白基因质粒pEGFP-C1转染不同细胞的性能。结果显示载体可以同DNA结合形成稳定的复合物，并且细胞的毒性显著低于PEI(25kDa)，四种材料表现出相当或高于PEI(25kDa)的转染效率，并随着氨基含量的升高，基因转染效率随之提高。
　　 第二部分主要是对大分子量的PEI(25kDa)进行聚乙二醇(PEG)化的修饰，主要目的是为了克服PEI(25kDa)的毒性，通过将PEG偶联到PEI(25kDa)上，可以有效的降低细胞毒性，增强在血清条件下的稳定性.结果表明通过PEG修饰，细胞的毒性有所降低，并且基因的转染效率由于PEG的屏蔽效应，也有所降低。
　　 第三部分主要是将低分子量的聚乙烯亚胺(PEI800)接枝到PEG-DTT上合成了一类新型的基因载体(PEG—DTT)-g-PEIs，研究了这类载体的细胞相容性及其与DNA形成复合物的性质，同时考察了载体介导pEFGP-C1基因分别转染人肝癌细胞HepG2以及人宫颈癌细胞Hela的性能，并对其在血清条件下转染肿瘤细胞的能力做出了评价。我们通过核磁，红外和GPC对它们的分子结构及分子量进行了表征。结果表明(PEG-DTT)-g-PEIs能有效地结合DNA形成纳米颗粒，并且纳米颗粒的直径低于200nm，表面电荷介于+20～+40mV之间.毒性试验显示载体具有比PEI(25KDa)低得多的细胞毒性.转染试验在Hela，HepG2，MCF-7和COS7这四种细胞系中进行，我们的载体都表现出来高于PEI(25KDa)的转染效率，并且在血清高达30％时，转染效率不受影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

第一节 基因治疗概述

1.1.1 基因治疗

1.1.2 基因治疗的方法

1.1.3 基因治疗中使用的基因载体

第二节 阳离子高分子基因治疗载体

1.2.1 阳离子高分子聚合物/DNA复合物的物理化学性质

1.2.2 影响基因转染效率的因素

1.2.3 用于基因传递的阳离子高分子载体

第三节 研究课题的提出及实验设计

1.3.1 研究课题的提出：

1.3.2 拟定的实验内容：

参考文献

第二章 小分子PEI接枝化聚[L-天冬酰胺-co-L-赖氨酸]作为基因载体的合成及性能研究

第一节 引言

第二节 材料及方法

2.2.1 实验材料与试剂

2.2.2 实验仪器与设备

2.2.3 实验方法

第三节 结果与讨论

2.3.1 PSL-PEI聚合物的合成及表征

2.3.2 PSL-PEI/DNA复合物的制备及琼脂糖凝胶电泳阻滞试验

2.3.3 对细胞毒性的测定(MTT法)

2.3.4 介导eGFP基因体外转染不同细胞的性能研究

本章小结

参考文献

第三章 PEG修饰的聚乙烯亚胺高分子的合成及其转染性能研究

第一节 引言

第二节 材料与方法

3.2.1 主要实验材料与仪器：

3.2.2 实验方法：

第三节 结果与讨论

3.3.1 PEG-PEI聚合物的合成及性能检测

3.3.2 PEG-PEI/DNA凝胶电泳阻滞实验

3.3.3 细胞毒性测定(MTT法)

3.3.4 PEG-PEI介导基因体外转染细胞的性能研究

本章小结

参考文献

第四章 小分子PEI接枝化PEG-DTT作为肿瘤靶向基因载体的研究

第一节 引言

第二节 材料与方法

4.2.1 主要实验材料与仪器：

4.2.2 实验方法：

第三节 结果与讨论

4.3.1 聚合物的合成及表征

4.3.2 凝胶电泳阻滞实验结果

4.3.3 复合物粒径及电位研究

4.3.4 细胞毒性研究

4.3.5 体外转染性质研究

本章小结

参考文献

第五章 全文总结

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果