花椰菜抗黑腐病相关基因的克隆及其在抗病育种中的应用

摘要

花椰菜是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一个变种，具有重要的经济价值。但在栽培过程中，黑腐病的大流行会使蔬菜品质严重下降，造成大幅度减产，使得针对该病成因及预防的研究成为科学家关注的热点。但是目前对植物抗黑腐病的研究进展主要集中在该病的遗传规律，以及对致病菌侵染的应答模式等方面，而在分子水平上对于抗黑腐病基因的研究却很少。本论文通过筛选抗黑腐病基因相关分子标记，同时结合电子克隆技术寻找候选的抗病基因，该研究对推进防治黑腐病的进程具有重要理论意义和应用价值。本文以花椰菜抗感黑腐病一对近等基因系为实验材料，在抗黑腐病基因筛选的研究中，首次将ISSR分子标记与电子克隆技术相结合，获得一个与花椰菜抗黑腐病相关候选基因BRR-C，然后采用Southern杂交技术证明了BRR-C在抗、感花椰菜黑腐病材料中的多态性。进一步将RT-PCR技术与RQ-PCR技术相结合，相应于菌体胁迫前后以及时间长度的变化，在抗、感花椰菜黑腐病材料中观察到与预期相符的BRR-C表达趋势，从而推测BRR-C很可能参与了花椰菜抗黑腐病的防卫机制，并对BRR-C可能参与的抗病机制进行了探讨。同时根据ISSR分子标记及BRR-C序列设计了三对SCAR标记引物，这对分子标记技术辅助抗性育种的应用具有重要意义。主要结果如下：
　　 ⑴应用ISSR分子标记技术，从近等位基因系材料中筛选得到了两条差异明显且重复性好的条带，即ISSR21200，ISSR17800。经过克隆测序后分析发现，ISSR17800与Brassica napus vat.napus的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AJ245479)具有93％的同源性；而ISSR21200与拟南芥中的一段EST序列(AK228713，hypothetical protein)有85％的同源性。
　　 ⑵利用分子标记ISSR21200作为种子序列，通过电子克隆技术获得抗黑腐病候选基因BRR(black rot resistance candidate genes)。随后依据BRR设计特异引物，在花椰菜基因组中分离到1条候选基因BRR-C(black rot resistance candidategenes of cauliflower)，经过克隆测序后分析发现，该序列全长2204bp，包含2个外显子和2个内含子，共编码484个氨基酸，与拟南芥逆转录转座子的逆转录酶基因存在高同源性。
　　 ⑶采用Southern杂交技术，将BRR-C与抗、感花椰菜黑腐病基因组进行杂交，结果表明BRR-C在抗、感病性材料中存在明显多态性，并且在花椰菜基因组中以低拷贝形式存在。
　　 ⑷依据BRR-C含有的保守序列设计一对特异引物，进行RT-PCR分析，结果表明BRR-C在胁迫条件下表达丰度提高。随后以不同时间段XCC胁迫的近等位基因系为材料，进行RQ-PCR(real-time-quantimtive PCR)分析，结果表明花椰菜中BRR-C的表达确实受到XCC的诱导。因此，我们认为BRR-C参与了花椰菜抗黑腐病的防卫机制，这为进一步克隆花椰菜抗黑腐病基因提供了可靠的候选基因。
　　 ⑸依据ISSR分子标记及BRR-C序列设计了三对SCAR引物，即TA1-2，TB1-2，TC1-2，设计片段长度分别为1200bp，1700bp，400bp。试验以花椰菜近等基因系以及大田中20个品系的花椰菜为材料进行检测，结果表明这三对SCAR标记引物具有很好的特异性，从而首次成功地将ISSR标记转化成了SCAR标记。这进一步拓宽了分子标记技术在辅助抗性育种中的应用，并且为花椰菜抗黑腐病品种的培育提供了快速检测手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词

声明

第一章 前言

第一节 概述

第二节 植物抗病相关基因的研究

1.2.1 植物抗病基因

1.2.2 植物反转录转座子在抗病过程中的作用

1.2.3 抗病基因的寻找方法

1.2.4 抗病基因的常用鉴定方法

1.2.5 甘蓝类蔬菜抗黑腐病研究

第三节 分子标记技术及其在植物育种中的应用

1.3.1 分子标记辅助选择

1.3.2 分子标记在植物抗性育种中的应用

第四节 本文选题的依据及研究内容

1.6.1 立题依据

1.6.2 研究目的及研究内容

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 试剂配制

第三节 试验方法

2.3.1 致病菌对植物材料的诱导处理

2.3.2 基因组DNA的制备

2.3.3 花椰菜幼苗总RNA的提取

2.3.4 总RNA的DNase Ⅰ处理

2.3.5 cDNA的合成

2.3.6 ISSR分析

2.3.7 3.5 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

2.3.8 目的片段的回收、克隆及测序

2.3.9 测序及电子克隆(in silico cloning)

2.3.10 Southern杂交

2.3.11 RT—PCR技术

2.3.12 Realtime—PCR分析

2.3.13 SCAR标记引物的设计及扩增

第三章 结果与分析

第一节 基因组DNA及总RNA的提取

3.1.1 基因组总DNA的提取

3.1.2 花椰菜总RNA的提取

第二节 ISSR分析

3.2.1 ISSR引物筛选及标记的获得

3.2.2 特异片段的克隆和序列分析

3.2.3 ISSR21200及ISSR17800的斑点杂交检测

第三节 电子克隆

3.3.1 ISSR21200的电子延伸

3.3.2 BRR—C序列的克隆鉴定

3.3.3 BRR—C的RT—PCR验证

3.3.4 BRR—C的Southern杂交模式

第四节 候选基因BRR—C的表达模式

第五节 SCAR标记及分析检测

第四章 讨论

第一节 花椰菜抗黑腐病的遗传学分析

第二节 电子克隆在花椰菜抗黑腐病基因克隆中的应用

4.2.1 候选基因BER—C的电子克隆

4.2.2 候选基因BRR—C的表达模式

第三节 分子标记辅助植物抗病育种的意义

4.3.1 分子标记的筛选

4.3.2 SCAR标记检验

第四节 后续的研究工作

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历