pH诱导牛血清蛋白微区结构及特性变化的荧光光谱研究

摘要

蛋白质的结构和性质对溶液环境酸碱程度有着很强的依赖性。但与溶液中的自由氨基酸pKa不同，蛋白质各残基pKa与其周围的环境密切相关。为了从结构变化获得信息，分子模仿技术得到了广泛应用。牛血清蛋白(BSA)是血浆中含量最丰富的蛋白，是含有唯一自由半胱氨酸的自然蛋白质。因此，为了深入探讨pH对蛋白质Cys活性残基的微区结构变化的影响，我们以牛血清蛋白为模型蛋白，通过荧光光谱方法对pH诱导蛋白质微区结构及特性的变化情况进行测量，并结合应用分子模拟的结果尝试进行解释。
　　 通过SWISS-MODEL进行同源模建得到牛血清白蛋白结构的初始结构。应用PKa预测方法能够得到蛋白质侧链的质子化状态。我们从BSA的唯一含巯基的半胱氨酸残基两侧截取了共21个氨基酸残基，并且对其进行结构优化。本研究中，采用5-Maleimido-fluorescein diacetate对BSA的半胱氨酸残基进行特异性标记，通过对荧光光谱和各向异性改变的分析，从而探讨探针标记的特定位点的局部构象和环境的变化。将模拟和实验的数据相结合，分析溶液pH改变诱导的蛋白质局部环境和构象的变化。
　　 实验表明，在BSA在不同pH值体系中，其荧光偏振值(FP)的大小会呈现出相应的变化。pH值为5时，FP最小。在强酸环境中，BSA的荧光偏振值随溶液酸度增强而增大，氢离子的结合使BSA微区残基带上了多余的正电荷。而在较强碱性环境中，BSA分子充分伸展，荧光偏振值整体较酸性环境大。而在pH值为11时，FP值反而有所降低。
　　 通过蛋白的特异性定点标记，结合生物信息学和荧光各向异性测量，研究了不同pH影响下蛋白质微区构象变化规律，为进一步探讨大分子的功能性蛋白提供良好的实验理论依据，具有重要意义。

目录

文摘

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第一章 引言

第二章 概述

第一节 牛血清蛋白介绍

2.1.1 牛血清蛋白结构特点

2.1.2 牛血清蛋白光谱性质

第二节 pH对BSA结构影响研究

第三节 蛋白质结构研究技术介绍

第四节 荧光偏振和各向异性介绍

2.4.1 荧光偏振和荧光各向异性

2.4.2 荧光各向异性应用

第五节 分子模拟技术

2.5.1 模拟中的质子化

2.5.2 分子动力学模拟

第三章 研究方法

第一节 研究方法整体设计

第二节 标记提纯

3.2.1 荧光标记

3.2.2 样品提纯

第三节 荧光测量

3.3.1 荧光偏振原理

3.3.2 荧光偏振测量

第四节 分子模拟

3.4.1 同源建模

3.4.2 动力学模拟

第四章 实验部分

第一节 荧光标记和提纯

4.1.1 仪器和试剂

4.1.2 实验样品准备

4.1.3 凝胶层析准备

4.1.4 样品标记提纯

第二节 荧光光谱及偏振测量

4.2.1 仪器和试剂

4.2.2 荧光测量实验

第五章 结果讨论

第一节 不同pH牛血清蛋白的荧光结果

5.1.1 pH环境对BSA的荧光光谱的影响

5.1.2 pH环境对BSA的荧光偏振的影响

第二节 不同pH牛血清蛋白的模拟结果

第三节 不同pH对BSA的影响讨论

第四节 总结与展望

5.4.1 总结和讨论

5.4.2 不足和展望

参考文献

致谢