灰树花真菌疏水蛋白HGFI在毕赤酵母中的表达、纯化及性质研究

摘要

真菌疏水蛋白是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类具有特殊生物物理活性的小分子量蛋白质，约含有100个氨基酸。这类蛋白质具有很高的表面活性，可以在两相界面处通过自我装配形成两性蛋白膜，进而改变原介质表面的亲水/疏水性质，具有较高的理论价值和应用价值。
　　 灰树花真菌疏水蛋白HGF I是本实验室从食用真菌灰树花Grifola frondosa中分离鉴定出的一个I型真菌疏水蛋白。研究表明HGF I具有很好的表面结合和修饰活性，在碳纳米管功能化、抗体固定化、生物医学材料表面修饰等封面均表现出优异的性能，具有很高的研究和应用价值。但由于灰树花真菌生长周期长、蛋白产量较低且分离纯化需要强氧化性酸三氟乙酸，限制了HGF I的研究和应用。
　　 本文通过构建毕赤酵母表达载体pPIC9-hgf1并将其成功转入毕赤酵母细胞，实现了真菌疏水蛋白HGF I在毕赤酵母中的大量表达。通过中空纤维膜超滤的方法，我们对毕赤酵母诱导表达的HGF I进行了浓缩和脱盐。超滤脱盐、浓缩的重组HGF I(rHGF I)在阳离子交换柱色谱层析中可以得到有效分离；Sephadex G75凝胶过滤柱层析同样也可以实现对超滤样品的有效分离。经对两种色谱方法纯化的蛋白进行蛋白和电泳分析表明超滤法结合阳离子交换柱层析法更适合作为纯化rHGF I的方法。
　　 对rHGF I修饰的硅化玻璃及云母表面接触角的测定，表明酵母表达的rHGFI具有和灰树花菌丝中提取的HGF I同样的表面活性。运用X-射线光电子能谱对rHGF I修饰的硅化玻璃表面进行元素分析，也检测到表面上C、N元素含量的明显提高，进一步说明毕赤酵母表达系统可以成功实现HGF I的活性表达。
　　 实验最后还对rHGF I在组织工程材料修饰方面的应用进行了初步研究，表明rHGF I可有效修饰ε-聚己内酯(PCL)电纺丝支架的表面，有效降低PCL支架的疏水性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

第一节 真菌疏水蛋白概述

1.1.1 真菌疏水蛋白的生物功能

1.1.2 真菌疏水蛋白的结构研究

1.1.3 真菌疏水蛋白的生产与纯化

1.1.4 真菌疏水蛋白的应用研究

第二节 灰树花真菌疏水蛋白研究进展

1.2.1 灰树花真菌的研究背景

1.2.2 灰树花真菌疏水蛋白的研究背景

1.2.3 为何选择毕赤酵母表达系统

第三节 本课题的研究意义及研究目的

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究意义

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料及仪器设备

2.1.1 菌种

2.1.2 质粒

2.1.3 引物合成(委托Invitrogen生物公司合成)

2.1.4 酶制剂及化学试剂

2.1.5 主要仪器设备

第二节 主要试剂及培养基配方

2.2.1 培养基配方

2.2.2 主要试剂配方

第三节 实验路线及操作方法

2.3.1 技术路线(图2.3.1)

2.3.2 灰树花真菌疏水蛋白HGF I在毕赤酵母中的表达

2.3.4 重组HGF I的结构和活性分析

2.3.5 重组HGF I的应用研究

第三章 实验结果和讨论

第一节 HGF I在酵母中的表达

3.1.1 灰树花真菌疏水蛋基因hgfl的克隆鉴定

3.1.2 毕赤酵母表达载体pPIC9—hgfl的构建

3.1.3 毕赤酵母电转化感受态细胞的制备和转化

3.1.4 毕赤酵母HGF I阳性转化子的筛选和鉴定

3.1.5 HGF I毕赤酵母高产菌株的筛选及蛋白表达鉴定

3.1.6 毕赤酵母HGFI表达条件的初步优化

3.1.7 HGF I表达后定位及可溶性分析

第二节 rHGF I的分离纯化

3.2.1中空纤维超滤对rHGF T诱导上清的浓缩

3.2.2 离子交换层析对真菌疏水蛋白的分离

3.2.3 Sephadex G75凝胶过滤柱层析对真菌疏水蛋白的分离

3.2.4 rHGF I蛋白的纯化策略

第三节 rHGF I结构和活性分析

3.3.1 rHGF I的N—末端序列及质谱分析

3.3.2 rHGF I对表面亲疏水性改变能力的检测

3.3.3 rHGF I表面结合能力的XPS分析

第四节 重组HGF I的应用研究

3.4.1 对聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)的修饰

第四章 结论

参考文献

致谢