致泻性大肠杆菌检测基因芯片的研制

摘要

致泻性大肠杆菌引起的腹泻疾病严重危害人类健康。为了预防致泻性大肠杆菌的感染，快速而准确地检测致泻性大肠杆菌是关键的技术基础之一。
　　 基因芯片是一种可以对核酸分子进行平行和高通量检测的技术，本文以食品中常见的四种致泻性大肠杆菌和危害严重的大肠杆菌O157为检测对象研制了病原菌检测用基因芯片。本文通过对毒力基因和表面抗原基因簇的分析，确定用于致泻性大肠杆菌检测的靶基因基因；用Oligoarray软件分别设计出特异探针，同时设计了所有通用探针和阴性对照探针，将探针加尾后固定在载玻片上，制成寡核苷酸芯片；提取大肠柑橘年基因组DNA后采用多重PCR的方法进行扩增，纯化扩增产物去除引物，用下游引物进行单链多重PCR，同时掺入Cy3_dUTP标记反义链，荧光标记后的产物和寡核苷酸芯片上的探针杂交，洗涤后用荧光扫描仪检测杂交信号。
　　 总计用176株菌进行了芯片性能评价，筛选得到了24条特异检测。完成了芯片的特异性、灵敏度、杂菌干扰试验和模拟样品试验，同时做了17例模拟样品试验。结果表明建立的芯片技术的检测方法具有操作简便，快速、特异性强、灵敏度高、准确性好等特点，为今后致泻性大肠杆菌在食品中的检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用提供了一定的技术和理论参考，具有广阔的应用前景，如可用于医学检验、食品卫生检测、环境监测、出入境检验检疫、卫生监督等领域。

目录

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第一章 引言

第一节 致泻性大肠杆菌

1.1.1. 大肠杆菌的生物学特性

1.1.2. 致泻性大肠杆菌分类

1.1.3. 致泻性大肠杆菌的检测

第二节 基因芯片技术简介

1.2.1 基因芯片概述

1.2.2 基因芯片检测微生物的原理及方式

1.2.3 基因芯片检测微生物的程序

1.2.4 基因芯片技术在微生物领域的应用

1.2.5 基因芯片在其他方面的应用

1.2.6 基因芯片技术的发展展望

第二章 材料和方法

第一节 试验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 引物与探针

2.1.3 主要酶与试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 仪器

2.1.6 软件

第二节 试验方法

2.2.1 检测范围的确定

2.2.2 靶基因的选择、分析和确定

2.2.3 引物和探针的设计

2.2.4 芯片点制

2.2.5 扩增和标记

2.2.6 杂交和洗涤

2.2.7 扫描和分析

2.2.8 结果分析

2.2.9 模拟样品的前期处理

2.2.10 基因组DNA的提取

第三章 结果与分析

第一节 引物的设计及引物浓度的优化

3.1.1 引物的设计

3.1.2 引物浓度优化

3.1.3 引物的扩增

第二节 探针的筛选

第三节 芯片性能评价

3.3.1 特异性

3.3.2 灵敏度

3.3.3 杂菌干扰试验

第四节 模拟样品试验

第四章 讨论

第一节 微生物检测技术的重要性和应用

第二节 关于探针设计和筛选

第三节 关于芯片杂交

4.3.1 靶序列扩增标记

4.3.2 杂交系统

第四节 基因芯片技术在病原微生物检验中的应用

4.4.1 基因芯片在病原微生物检测中的应用

4.4.2 基因芯片技术在病原微生物耐药性检测中的应用

4.4.3 应用基因芯片技术诊断病原微生物存在的问题和前景

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简介及科研成果