探讨Fra-1调节巨噬细胞中IL-6的表达并促进M2d型巨噬细胞生成的机制

摘要

目的:将小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)与乳腺癌细胞系(4T1)共培养,探讨在肿瘤微环境中乳腺癌细胞诱导巨噬细胞分化为M2d型巨噬细胞的机制。
　　 方法:RAW264.7与4T1细胞以1:4比例共培养,应用流式细胞技术检测M2型巨噬细胞比例,ELISA法检测细胞上清中IL-6的含量,分离纯化两种细胞后,应用RT-PCR和Realtime检测M1、M2型巨噬细胞相关细胞因子及IL-6、Fra-1的mRNA表达量,Western blot法检测癌蛋白Fra-1蛋白水平表达量,ChIP方法检测Fra-1与IL-6启动子的结合活性。随后在共培养细胞中加入抗IL-6抗体(500ng/ml)和或LPS(100ng/ml)或采用小干扰RNA的方法沉默Fra-1基因,再行相应检测。
　　 结果:RAW264.7和4T1细胞共培养后,RAW264.7细胞的表型明显改变,M2型巨噬细胞比例显著增加,添加抗IL-6抗体后M2型巨噬细胞比例明显下降；与野生型RAW264.7细胞相比,共培养RAW264.7细胞的M2型巨噬细胞相关细胞因子的mRNA表达水平增高,M1型巨噬细胞相关细胞因子mRNA表达水平降低,Fra-1 mRNA和蛋白水平表达增高,Fra-1与IL-6启动子的结合活性增加；与单独培养细胞相比,共培养细胞上清液中IL-6含量均明显增加(P均<0.05)；IL-6 mRNA在共培养RAW264.7细胞中表达显著增高,而在共培养4T1细胞中表达轻微增加；共培养细胞中加入抗IL-6抗体或沉默RAW264.7细胞中Fra-1基因后,能抑制共培养RAW264.7细胞表型的改变。
　　 结论:RAW264.7和4T1细胞共培养后,Fra-1癌基因调节巨噬细胞中IL-6的表达,从而促进M2d型巨噬细胞的生成。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 前言

第一节 肿瘤微环境与肿瘤相关巨噬细胞

1.1.1 肿瘤微环境

1.1.2 巨噬细胞的功能及分类

1.1.3 M2d型巨噬细胞

第二节 M2d型巨噬细胞的生成

1.2.1 M2d型巨噬细胞生成的概述

1.2.2 白细胞介素-6与M2d型巨噬细胞的关系

1.2.3 IL-6启动子结构与Fos样抗原1

第三节 我们的实验

1.3.1 主要实验方法

1.3.2 实验思路

第二章 材料与方法

第一节 主要仪器和试剂

2.1.1 主要仪器

2.1.2 实验细胞

2.1.3 主要试剂

第二节 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 RNA干扰

2.2.3 RT-PCR

2.2.4 实时定量PCR(Realtime quantitative PCR)

2.2.5 Western blot检测

2.2.6 ELISA检测

2.2.7 流式细胞技术检测及细胞分选

2.2.8 染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)

2.2.9 统计学分析

第三章 结果

第一节 4T1细胞能诱导RAW264.7细胞分化为M2d型巨噬细胞

第二节 C-RAws产生的IL-6通过自分泌形式诱导M2d型巨噬细胞生成

第三节 Fra-1与IL-6启动子的结合活性调节IL-6的表达并促进M2d型巨噬细胞的生成

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历

附录 A(研究论文)

附录 B(研究论文)