酵母内质网嵌膜GTP酶Seylp的表达、纯化及结晶

摘要

内质网是广泛分布于真核细胞中的一类在形态、功能上保守的细胞器。在形态学上，可以将内质网分为管状内质网、片层状内质网两大基本形态，并且这两种形态发挥着不同的生理功效。现已有研究发现，许多蛋白质参与到了管状内质网形态的维持这一过程中。Seylp蛋白是酵母体内的一类dynamin家族GTPase膜嵌GTPase蛋白，定位于内质网并在管状内质网处富集。有研究表明Seylp与其哺乳动物同源蛋白A1tastin对管状内质网的形态维持起到关键的作用。为了研究Seylp蛋白如何维持管状内质网形态，以及其探究其介导膜的融合/裂解方面的分子机制，本研究从结构生物学、生物化学的角度出发来研究Seylp蛋白在对内质网塑形方面的精确工作机制。
　　 本实验首先成功构建了Seylp的N端胞浆区全长的载体，然后通过二级结构预测、胰酶不完全降解实验、质谱分析以及对Seylp结构域的分析，确定了不同的克隆片段，并将蛋白在大肠杆菌中进行表达，利用不同的纯化方法最到了高纯度的蛋白。接下来，通过分子筛层析分析、GTPase酶活分析等手段确定了具有生物学活性且性质稳定的蛋白片段。在此基础上对相应蛋白进行了晶体的筛选工作，最终得到了相应的蛋白晶体，但X衍射初步分析表明，晶体的衍射效果不佳。
　　 为了提高晶体的衍射质量，对蛋白进行了不同处理，对结晶条件进行了进一步优化，并通过对晶体本身进行了不同方式的处理。通过综合运用以上手段，极大的提高了晶体的衍射质量。通过目前所得到的研究结果，使我们对Seylp蛋白发挥生理功效的方式有了进一步的了解，并为Seylp结构的最终解析以及阐明Sey1p在对管状内质网的塑形方面的分子机制奠定了坚实的基础。